肉苁蓉的活性成分分析及其对蛙离体心脏的影响

2023-06-27糟亚男王世锋王玉州

中国民族民间医药·上半月 2023年3期

糟亚男王世锋王玉州

【摘要】

目的：研究肉苁蓉中的活性成分苯乙醇苷、多糖、甜菜碱的含量，抗氧化能力以及对蛙离体心脏的影响。方法：采用超声波提取法提取苯乙醇苷、甜菜碱，热水浸提法提取多糖，用紫外-可见光分光光度法测定其含量，用DPPH法测其抗氧化能力；采用斯氏蛙心灌流法，用BL-420N生物信息采集与分析系统来测定肉苁蓉提取液对离体蛙心脏的影响。结果：测出苯乙醇苷、多糖、甜菜碱的含量分别为23.22%、25.3%、1.18%，对DPPH的清除率分别为78.1%、93.42%、66.52%。水提液、甜菜碱提取液对蛙心脏有抑制作用，苯乙醇苷提取液对蛙心脏无明显作用，多糖提取液对蛙心脏有兴奋作用。结论：三种提取液都具有一定的抗氧化作用，提取液对蛙心脏也有明显作用。

【关键词】

肉苁蓉；苯乙醇苷；多糖；甜菜碱；蛙心灌流

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2023）05-0023-05

Analysis of Active Components of Cistanche Deserticola and Tts Effect on Isolated Frog Heart

ZAO Yanan1，2 WANG Shifeng1* WANG Yuzhou1

1.Key Laboratory of Biological Resources and Ecology of Pamir Plateau in Xinjiang Uygur Autonomous Region， College of Life and

Geography Sciences， Kashi University， Kashi 844006，China；2.Huocheng County Jiangsu Middle School，Yili 835200，China

Abstract：

Objective To study the contents of phenylethanolic glycosides， polysaccharides and betaine in Cistanche deserticola，its antioxidant capacity and its effects on frog isolated heart.Methods Phenylethanol glycoside and betaine were extracted by ultrasonic extraction， polysaccharide was extracted by hot water extraction， its content was determined by UV-vis spectrophotometry， and its antioxidant capacity was measured by DPPH method;The effect of Cistanche deserticola extract on isolated frog heart was determined by bl-420n biological information acquisition and analysis system.Results The contents of phenylethanol glycoside， polysaccharide and betaine were 23.22%， 25.3% and 1.18% respectively， and the clearance rates of DPPH were 78.1%， 93.42% and 66.52% respectively. Water extract and betaine extract have inhibitory effects on frog heart，Phenylethanolic glycoside extract had no obvious effect on frog heart， and polysaccharide extract had stimulating effect on frog heart.Conclusion The three extracts have certain antioxidant effect， and the extract also has obvious effect on frog heart.

Keywords：

Cistanche Deserticola;Phenylethanol Glycoside;Polysaccharide;Betaine;Frog Heart Perfusion

肉苁蓉，列当科，俗名寸芸、田大云等，属濒危种。属于草本目，高0.4～1.6 m，大多数地下生［1］。多分布在内蒙古、甘肃及新疆等地，内蒙古比较多。肉苁蓉是一种寄生在梭梭根部的寄生类植物，从梭梭中获取营养。有“沙漠人参”之称，它有很高的药用价值，是中国古代的珍稀中草药材。

管花肉苁蓉自然分布在新疆南疆地区，植株形态与肉苁蓉差异较大，管花肉苁蓉在20世纪60年代代替肉苁蓉开始入药［2］。在20世纪90年代，管花肉苁蓉被收录入《中国药典》（2005年版），这为全球提供了一种具有很高含量苯乙醇苷的肉苁蓉品种。

肉苁蓉中含有苯乙醇苷、环烯醚萜类及其苷类、木脂素类及其苷类、挥发性成分以及其他类化合物，其他类化合物主要是生物碱、糖类等［3］。苯乙醇苷是肉苁蓉属植物的主要活性成分之一，对紫外吸收能力很强，具有抗氧化、抗病毒、抗炎抗菌、抗腫瘤等功能。近年来，屠鹏飞等［4］研究发现肉苁蓉属植物所含的苯乙醇苷类成分具有治疗老年痴呆症、帕金森病和心肌缺血等的作用，并阐明了其作用机制，为肉苁蓉临床新的应用和开发利用提供依据。侯晓甜［5］研究发现苯乙醇总苷对机体有抗肿瘤的作用，它能通过诱导肿瘤细胞的自噬性死亡来抑制H22荷瘤小鼠皮下移植瘤生长。多糖是一种高分子化合物，又称为多聚糖，肉苁蓉多糖具有调节免疫活性、保护神经、抗骨质疏松功能。孙云等［6］研究发现肉苁蓉多糖可以控制肺胶原蛋白增多和弹性胶原蛋白降低，以及调节机体抗氧化功能。王晓琴等［7］研究发现肉苁蓉多糖具有一定抑制细菌及真菌生长的作用。甜菜碱是一种生物碱，是一种季铵化合物，肉苁蓉中的的甜菜碱具有抗氧化活性，还有很好的抗肿瘤、抗衰老作用。张静等［8］研究发现在肉苁蓉中随着糖浓度的增加甜菜碱含量也随之升高。陈卫军等［9］研究发现新疆管花肉苁蓉不同炮制品中甜菜碱的含量差异很大。肉苁蓉在国外在被用来作为性机能障碍和健忘症的治疗剂或改善剂［10］。

蛙心灌流为观察心脏、研究治疗心脏疾病的药物提供了非常好的模型。现国内已有肉苁蓉苯乙醇苷、多糖以及黄酮等活性成分含量及抗氧化能力的各种研究，但尚未见到有关管花肉苁蓉提取的活性成分对离体蛙心脏的影响研究报道。

1 材料与方法

1.1 材料本文采用样本是肉苁蓉属中的管花肉苁蓉。它是新疆维吾尔自治区南疆地区特有的肉苁蓉，主要分布在塔里木盆地南缘，寄生在柽柳根部，由喀什疏勒县喀什遇见您果业有限公司提供。

1.2 主要药品及仪器松果菊苷标准品、葡萄糖对照品、甜菜碱对照品、D101型大孔吸附树脂、DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、活性炭、利英纳克盐（雷氏盐）、蒽酮等。双频数控超声波清洗器、旋转蒸发仪、紫外可见分光光度计，BL-420N生物信号采集分析系统，张力换能器等。

1.3 方法

1.3.1 苯乙醇苷的提取纯化及抗氧化测定参照仵红磊［11］的提取方法，称10g过40目筛的肉苁蓉粉末，按1∶16的料液比，频率45 kHz，功率160 W，温度67 ℃，提取两次，每次40 min。合并滤液并抽滤，随后旋转蒸发，用同体积水饱和的乙酸乙酯和正丁醇萃取，重复三次，浓缩后稀释。称取0.9g湿大孔吸附树脂，用滤纸吸干，放入三角瓶中，在瓶中加入稀释后的样液8 mL，18 ℃恒温水浴震荡10 h，150次/h。

苯乙醇苷的标准曲线测定：取松果菊苷对照品10 mg溶到甲醇中，定容至25 mL，充分摇匀。分别吸取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容到刻度线。甲醇作为空白对照，在334 nm波长处测其紫外吸收值。

参考仵红磊［11］的抗氧化检测方法，首先将2.5 mg DPPH标准品溶于无水乙醇中并定容到100 mL，充分摇匀，然后用报纸包裹，避光保存。吸取2 mL纯化后的样液于试管，再滴入配好的2 mL DPPH溶液在517 nm处测其吸光值作为Ai值，吸取2 mL乙醇于试管中，再加入2 mL纯化后的样液在同一波长下测定吸光值作为Aj值，吸取2 mL DPPH溶液于试管中，再加入2 mL无水乙醇同样也在该波长下测其吸光度，无水乙醇作空白对照。

根据待测样品对DPPH的清除率公式：

K=［1-（Ai-Aj）/Ac］×100%。

1.3.2 多糖的提取方法及抗氧化测定参考王晓琴等［7］的提取方法提取肉苁蓉的多糖。称取粉末3 g，装入烧杯中，加入95%的乙醇浸泡24 h，过滤留渣，将滤渣烘干。然后用热水浸提，恒温水浴锅调至85 ℃，浸提两次，每次2 h，中途可不断加少量水。再次过滤，留取滤液，合并两次滤液并蒸发浓缩到原体积的1/5，加入4倍体积的95%乙醇，搅拌混匀，放入冰箱冷藏24 h。离心取沉淀，离心转速设置为3000 r/min，时间为10 min。用Ssevage法除蛋白（氯仿：正丁醇=4∶1），将提取液与试剂1∶1放入分液漏斗中充分摇匀，静置，观察直到没有乳白色析出，取出上清液定容至50 mL。

多糖的标准曲线测定：分别吸取0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖溶液，再吸取蒸馏水2 mL做空白对照，放于具塞试管中加蒸馏水至2.0 mL。吸取6.0 mL1 mg/mL的蒽酮硫酸溶液，分别加到几个试管中，摇匀，静置15 min，再置于冰水浴中冷却15 min。在625 nm处测其吸光值。

参考郭俏俪等［12］的方法，精确称取DPPH样品4.5 mg放入三角瓶中，加入100 mL无水乙醇溶解，封口，用纸包裹，避光保存。得到浓度为0.08 mL/L的DPPH溶液，尽量现配现用。取样品2 mL，放入试管中，再加入3 mL配好的DPPH溶液，避光静置存放30 min，以蒸馏水作为空白对照，在517 nm处测其吸光值。参考上述公式。

1.3.3 甜菜碱的提取及抗氧化测定参考王英姿等［13］的提取方法提取肉苁蓉甜菜碱。精确称取粉末3 g，放入三角瓶中，加入适量75%乙醇静置过夜，封口。取出后过滤，留取滤渣。加入100 mL的蒸馏水放入超声波中提取，时间为30 min，频率为35 kHz;过滤，保存滤液，将滤渣再次提取，过滤后将滤液与第一次滤液合并，并蒸发浓缩至适量。量取20 mL上述样液放入50 mL的烧杯中，加入1.0 g活性炭煮沸并过滤，取出滤液，滴入浓盐酸使其pH值为1（在pH值为1时，甜菜碱会与利英纳克盐发生反应产生沉淀）。

甜菜碱的标准曲线测定：精确称取20 mg的甜菜碱标准品，加入10 mL的蒸馏水，充分混匀。分别吸取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL的标准溶液放入离心管中，不足3 mL的用蒸馏水补至3 mL，放入冰水浴中冷却15 min，取出加入雷氏盐溶液5 mL（精确称取1.5 g利英纳克盐，加蒸馏水100 mL，用浓盐酸调节Ph为1，在室温条件下，搅拌45 min，用前配置好），充分摇匀，再次置于冰水浴中冷却3 h。取出离心，离心机为4000 r/min，离心15 min，取出沉淀，用70%的丙酮溶解并定容到25 mL容量瓶刻度线。在525 nm处测其吸光度数值。

参考苯乙醇苷的抗氧化能力测定。

1.3.4 肉蓯蓉提取液对离体蛙心脏的影响肉苁蓉水提液的制备：称取肉苁蓉粉末3 g，再加入45 mL蒸馏水，水浴提取2次，温度为80 ℃，合并两次提取液，蒸发浓缩。静置避光保存，备用。

根据蒋方等［14］的方法配置任氏液并解剖牛蛙做蛙心灌流实验。本文采用斯氏蛙心灌流法。

2 结果与分析

2.1 苯乙醇苷的含量及抗氧化能力测定根据1.3.1绘制苯乙醇苷标准曲线测得各浓度的吸光度数值，经线性回归处理的标准曲线为Y=0.0659X-0.0201，R2=0.9983。根据标准曲线的测量方法测出肉苁蓉苯乙醇苷提取液的吸光度数值为0.602，由线性回归方程得出样液浓度约为9.44 μg/mL。根据含量公式得出含量为28.32%。根据1.3.1最终得出肉苁蓉苯乙醇苷提取液对DPPH的清除率约为78.10%。说明肉苁蓉苯乙醇苷提取液具有抗氧化能力。

2.2 多糖的含量及抗氧化能力根据1.3.2绘制多糖的标准曲线测得各浓度的吸光度数值，经线性回归处理的标准曲线为Y=4.6469X-0.0062，R2=0.9984。根据标准曲线的测量方法测出肉苁蓉多糖提取液的吸光度数值为3.510，由线性回归方程得出样液浓度约为0.76 mg/mL。根据含量公式得出含量为25.3%。根据1.3.2最终得出肉苁蓉多糖提取液对DPPH的清除率约为 93.42%。说明肉苁蓉多糖提取液具有抗氧化能力。

2.3 甜菜碱含量及抗氧化能力根据1.3.3绘制甜菜碱的标准曲线测出各浓度的吸光度数值，经线性回归处理的标准曲线为Y=1.1653X-0.0138，R2=0.9894。根据标准曲线的测量方法测出肉苁蓉甜菜碱提取液的吸光度数值为0.194，由线性回归方程得出样液浓度约为0.178 mg/mL。根据含量公式得出含量为1.18%。根据1.3.3最终得出肉苁蓉甜菜碱提取液对DPPH的清除率约为66.52%。说明肉苁蓉甜菜碱提取液具有抗氧化能力。

2.4 肉苁蓉提取液对离体蛙心脏的影响将肉苁蓉提取液加入离体蛙心脏中，用张力换能器和BL-420N生物信号采集系统分析蛙心搏曲线。肉苁蓉水提液加入后，心搏曲線如图1所示，蛙的心肌收缩力下降15%，心率减慢33%，说明肉苁蓉水提液对蛙心脏有明显抑制作用。肉苁蓉苯乙醇苷提取液加入后，心搏曲线变化如图2所示，蛙心脏未出现明显变化，说明肉苁蓉苯乙醇苷提取液对蛙心脏无抑制作用。肉苁蓉多糖提取液加入后，心搏曲线变化如图3所示。蛙的心肌收缩力增加20%，心率无变化，说明肉苁蓉多糖提取液对蛙心脏有明显兴奋作用。肉苁蓉甜菜碱提取液加入后，心搏曲线变化如图4所示。蛙的心肌收缩力下降75%，心率减慢，说明肉苁蓉甜菜碱提取液对蛙心脏有明显的抑制作用。

3 讨论与结论

3.1 肉苁蓉不同活性成分的含量研究现今肉苁蓉中苯乙醇苷的含量测定一般采用比色法、紫外分光光度法、RP-HPLC（反相高效液相色谱）法等。仵红磊［11］采用紫外分光光度法测得肉苁蓉中的苯乙醇苷含量为20.01%。本论文采用此方法并进行了一些调整，提取温度为67 ℃，测得肉苁蓉中的苯乙醇苷含量为28.32%。造成含量差异的原因是产地不同或者实验提取温度不同。紫外分光光度法操作简单，准确快速，值得推广。目前，肉苁蓉中多糖的含量测定通常采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法以及DNS法（二硝基水杨酸比色法）。李艳等［15］采用苯酚-硫酸法测定肉苁蓉中的多糖含量为13.22%。艾拉旦［16］采用硫酸-蒽酮法测得肉苁蓉多糖的含量为5.76%，盛惟等［17］采用硫酸-蒽酮法测得肉苁蓉多糖的含量为69.64%。本论文采用硫酸-蒽酮法方法进行含量测定，测出含量为25.30%。相比于其他学者的研究产生误差的原因可能是原料产地的不同或者实验方法的不同。硫酸-蒽酮法与苯酚-硫酸法之间各有各的特点。苯酚硫酸法中苯酚易氧化，而硫酸-蒽酮法中溶液具有不稳定性。近几年，肉苁蓉中甜菜碱的含量测定一般采用紫外分光光度法。张淑运等［18］采用此方法测出肉苁蓉中的甜菜碱含量平均值为4.21%，本论文也采用同样的方法测出肉苁蓉中的甜菜碱含量为1.18%。两者相比含量不同的原因可能是产地的不同或者提取方法的不同。紫外分光光度法方便快捷，适合广泛推广。

3.2 肉苁蓉抗氧化能力的测定抗氧化物质可与超氧化物歧化酶等酶类或抗氧化物质协同构成抗氧化联合系统，增强机体的抗氧化能力，修复损伤的DNA，使体内的基因能够正常表达。抗氧化不仅可以延缓人体皮肤的衰老，也可以预防疾病，据统计大部分恶性疾病都与自由基有关，比如常见的癌症、糖尿病、老年痴呆等。现如今测抗氧化活性的方法一般有邻苯三酚法，铁离子法以及DPPH法，本论文采用DPPH法测定肉苁蓉苯乙醇苷、多糖、甜菜碱的抗氧化活性。仵红磊［11］采用DPPH法测定肉苁蓉中的苯乙醇苷抗氧化活性，测得值为76.78%，本文采用同种方法测得苯乙醇苷抗氧化活性为78.10%，两者产生误差的原因可能是因为南北疆的气候与光照；郭俏丽等［12］采用DPPH法测定兰州肉苁蓉中多糖的抗氧化活性，测得值高达91.73%，本论文也采用该方法测得管花肉苁蓉中多糖的抗氧化活性值为93.42%。产生差异的原因可能是肉苁蓉品种的差异或者生长环境的不同。董孝元等［19］采用DPPH法测得苦荞酒中甜菜碱的抗氧化活性为75%，文本采用同种方法测得肉苁蓉中甜菜碱的抗氧化活性为66.52%，两者甜菜碱的抗氧化活性不同的原因可能是材料的不同或者提取方法的不同。肉苁蓉中苯乙醇苷、多糖、甜菜碱三者均有抗氧化活性，多糖抗氧化能力最高，其次为苯乙醇苷，最后为甜菜碱。

3.3 肉苁蓉提取液对离体蛙心脏的影响肉苁蓉中的多糖对牛蛙心脏具有兴奋作用，而水提液和甜菜碱对其有抑制作用，苯乙醇苷无明显作用。蓝天伟［20］研究发现苯乙醇苷对心脏具有保护作用，池雪林等［21］研究发现牛膝多糖在浓度超过500 μg/mL时会使牛蛙心脏具有兴奋作用，本试验中肉苁蓉多糖对离体蛙心脏具有兴奋作用可能是肉苁蓉多糖在心肌细胞膜上的钙通道调控有关。

水提液与甜菜碱对离体蛙心脏具有抑制作用，水提液加入后抑制可能是其中含有少量总黄酮，而黄酮中的槲皮素可以通过改善脂氧素抑制移植心脏收缩力，或可能是通过影响心肌膜上的Ca2+通道的活性，减少Ca2+内流起作用的；心率减慢可能是通过影响窦房结的自律性起作用，而甜菜碱加入后抑制可能是抑制Ca2+内流而导致心肌力迅速收缩骤停，也可能是由于甜菜碱对细胞通透性的改变所引起的。

本文研究发现肉苁蓉提取液苯乙醇苷、多糖以及甜菜碱均有一定程度的抗氧化活性，其中多糖抗氧化能力最高，苯乙醇苷次之，甜菜碱最后。肉苁蓉水提液对离体蛙心脏具有抑制作用，苯乙醇苷对离体蛙心脏无明显作用，多糖对离体蛙心脏有兴奋作用，甜菜碱对离体蛙心脏有抑制作用。肉苁蓉作为珍稀药材，它有自己独有的药理活性及价值，进一步研究或许能有重大发现。

参考文献

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