钙稳态及稳态失衡在缺血再灌注损伤中的研究进展*

马 宾, 丁莹梅, 刘晓芬, 朱铃强, 袁 梅△

1南华大学附属第二医院神经内科,衡阳 421001 2华中科技大学同济医学院基础医学院病理生理学系,武汉 430030

急性缺血性心脑血管疾病缺血再通已证明对组织具有保护作用,但再灌注过程本身可以放大细胞损伤和死亡,它也会在心外膜、脑组织血流恢复后产生一定的缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)[1-2]。IRI病理生理改变包括氧化应激、钙失衡、线粒体损伤、过度炎症反应、内质网应激和程序性细胞死亡等,它们互为因果,形成恶性循环[3],从而损害血运重建治疗带来的临床益处。生理情况下,细胞通过一系列转运机制保持胞膜内外钙离子浓度差,维持胞内低钙状态,即钙(calcium,Ca)稳态。Ca2+是控制细胞功能的细胞内信使,细胞内钙离子通道也是钙离子功能发挥的基础,但细胞内钙超载可能具有潜在毒性并导致细胞死亡。

Jennings等[4]首先描述了出现在急性缺血性损伤中的钙超载。后来,广大研究者认识到,细胞Ca2+水平的巨大变化是由细胞质膜、线粒体、内质网/肌浆网和一些细胞间连接等引起的,再灌注过程介导的细胞内和线粒体内Ca2+浓度的过度升高使细胞出现过度收缩、蛋白酶激活和线粒体衰竭等功能障碍,故调节钙稳态被认为是控制IRI进展的主要因素。在几十年发展过程中,对钙稳态和细胞之间的结构和功能关联的研究日趋深入。本文讨论和总结了IRI发生时Ca2+在细胞内及细胞间的调控机制以及对该机制的最新见解。

1 细胞质膜钙稳态调节

细胞膜通过各种通道、受体及钙调节蛋白质控制细胞内和细胞外Ca2+之间的平衡,从而维持Ca2+稳态。细胞表面通道和受体的刺激增加细胞内Ca2+浓度,细胞质膜上存在多种Ca2+通道,包括瞬时受体电位离子通道(transient receptor potential,TRP)、电压门控Ca2+通道(voltage-gated calcium channels,VGCC)、钙敏感受体(calcium-sensing receptor,CaSR)、Na+/Ca2+交换器(Na+/Ca2+exchanger,NCX)和质膜Ca2+-ATP酶(protein misfolding cyclic amplification,PMCA)等,这些被认为是质膜上主要钙稳态维持器。

1.1 质膜CaSR、TRP、VGCC介导钙离子内流

CaSR是G蛋白耦联受体超家族C家族的成员之一。在发生IRI时,CaSR可被细胞外细微的钙离子含量增多而激活,活化的CaSR可介导激活磷脂酶C系统,促使肌浆网释放钙离子,细胞外钙内流和细胞内钙库释放引起的细胞内钙离子浓度的升高均受CaSR的调节[5]。CaSR已被证明参与调节许多细胞和组织中的炎症反应,CaSR异常激活可通过激活丝裂原活化蛋白激酶、磷酸化蛋白激酶-δ易位、钙超载、Fas受体等通路来促进心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)[6-7]。有研究通过构建动物急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)、大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型和体外糖氧剥夺/复氧(oxygen glucose deprivation/re-oxygenation,OGD/R)模型发现,黄芪甲苷可通过抑制CaSR表达,并增加ERK1/2磷酸化水平达到对心脏的保护作用[8]。黄芪甲苷也可以通过降低大鼠神经功能缺损评分、减少脑梗死体积和促进PC12细胞活力,以及抑制IRI诱导的cleaved Caspase-3和CaSR的表达来缓解IRI。心循环系统中的多形核中性粒细胞可通过增强各种酶和细胞因子的释放来损伤心肌缺血再灌注(I/R)后的组织[9],Zhai等[10]在体内实验证实了多形核中性粒细胞可以通过心脏外泌体中特异性的lncRNA3986减少心脏IRI并保护心肌,源自CaSR激活剂西那卡塞刺激的多形核中性粒细胞分泌的外泌体减少了心肌梗死面积并改善了心脏功能。也有研究者[11]探索了I/R诱导的单核细胞趋化蛋白-1下游的级联反应,它通过单核细胞趋化蛋白1诱导的蛋白1内质网应激和CaSR途径调节心肌细胞死亡。Liu等[12]证实了CaSR激活磷酸化蛋白激酶C-δ在I/R过程中通过内质网应激相关的凋亡途径诱导心肌细胞凋亡。在这些研究中,用到的CaSR抑制剂NPS-2390和NPS-2143参与IRI诱导的细胞凋亡,但潜在机制仍不明确。值得进一步研究的是,Zhai等[10]以暴露于NPS-2143的PMN中提取外泌体,设计体内实验,不同组之间的结果差异没有统计学意义,他们怀疑有其他细胞或物质的参与。

TRP是一种Ca2+可渗透的非选择性离子通道,以M家族M2亚型在IRI中研究最为广泛[13-14]。TRPM2介导的许多细胞功能都需要在氧化应激下刺激Ca2+内流[15]。氧化应激和炎症反应在IRI中的作用相辅相成,氧化应激介导的Ca2+信号传导对于引发免疫细胞中的炎症反应至关重要[16],氧化应激通过增加二磷酸腺苷核糖焦磷酸酶(adenosine diphosphate ribose,ADPR)和Ca2+的产生间接激活TRPM2。在炎症过程中,线粒体中的活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生增加也使ADPR的产生增加,促进了TRPM2介导的Ca2+内流[17],进一步增加了线粒体中ROS的产生,形成恶性循环。体内实验证实,在tMCAO模型中,使用TRPM2抑制剂或者将TRPM2敲除小鼠的骨髓移植到野生型小鼠中,可减少MCAO后梗死面积[18-19]。Hu等[20]证实TRPM2缺失减少了ROS依赖性IRI和OGD/R诱导的神经元死亡。此研究进一步发现,脑IRI产生ROS激活TRPM2,进而下调AMPK/mTOR通路,抑制自噬。此外,也有实验证实[21],将TRPM2敲除小鼠进行左冠状动脉主干结扎后再灌注实验时,TRPM2(-/-)小鼠比TRPM2(+/+)小鼠的I/R后心肌梗死减少更多,提示由TRPM2激活介导的再灌注区域中性粒细胞的积累可能在心肌I/R损伤中起关键作用。新近一项研究表明,TRPM2介导的Ca2+内流通过Pyk2磷酸化调节心脏中线粒体对Ca2+的摄取,随后其易位至线粒体,导致线粒体Ca2+摄取增强,在IRI中发挥重要作用[22]。近年来,冷冻电镜对TRPM2高分辨率原子结构的完整揭示为开发更特异和有效的TRPM2抑制剂奠定了基础[14],TRPM2特异性抑制剂与高度组织/细胞特异性纳米递送载体的结合,可以使TRPM2抑制疗法在治疗缺血性疾病中的应用成为可能。

VGCC在离子通道中占有独特的地位,它介导的Ca2+通量不仅可以产生动作电位,而且VGCC对Ca2+的选择性渗透推动了细胞质Ca2+浓度的增加,这种浓度仅在离子中触发下游信号通路[23-24]。按照编码α1亚基的同源序列型,VGCC可分为Cav1、Cav2、Cav3这3个家族[25],Cav1以L型钙通道为主,Cav1.2和1.3存在于脑、心脏等多种可兴奋细胞。早有研究表明[26],当给予L-VGCC的拮抗剂后,I/R诱导的总蛋白酪氨酸激酶和酪氨酸活性下降,IRI可能是通过N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)和L-VGCC介导的。在体内条件下,通过腹膜内注射VGCC激活剂和侧脑室内注射NMDA,磷酸化AKT和磷酸化CREB等细胞存活相关信号分子均下降,给予相应干预措施后可通过NMDA受体或经VGCC的钙流入激活钙调蛋白激酶,进而磷酸化GluN2B-Ser1303导致皮层和海马细胞死亡[27]。邢影等[28]测量了脑缺血皮层神经元Ca2+变化情况,发现L-VGCCs电流Ⅰ～Ⅴ曲线呈时间依赖性,证明了过度开放L-VGCCs与IRI有关。国外学者进行了大鼠脑微血管内皮细胞与血脑屏障关系的体内和体外实验[29],发现全身给予溶血磷脂酰肌醇可以促进大鼠脑微血管内皮细胞的Ca2+内流,增加血脑屏障通透性,但是通过应用硝苯地平抑制L-VGCC或在无Ca2+盐水中这种内流被消除,表明溶血磷脂酰肌醇可通过影响L-VGCC参与血脑屏障破坏。在大鼠冠状动脉结扎I/R模型研究中,发现内皮素B受体依赖的VGCC的Ca2+内流,可以在I/R中诱导表型转变[30]。三甲基锡中毒动物模型中,三甲基锡以剂量依赖性方式影响VGCC诱导的细胞内Ca2+稳态变化,启动神经炎性变化,引起神经毒性[31]。

1.2 质膜NCX、PMCA介导细胞内钙外流

钠钙交换体(sodium-calcium exchanger,NCX)被认为是Ca2+流出质膜的重要途径[32]。NCX有2种工作方式:前向型指将钠离子转入细胞内、钙离子转出细胞,反向型指将钙离子转入细胞内、钠离子转出细胞。细胞内Na+升高导致星形胶质细胞中NCX反向模式激活在OGD/R后发挥重要作用[33]。动物实验证实NCX2和NCX3都与脑缺血有关,NCX3是急性缺血性脑卒中神经保护的下游参与者[34-35],敲低和敲除NCX3会导致tMCAO或pMCAO引起的2种不同缺血模型的局灶性缺血损伤扩大[36]。虽然谷氨酸长期以来一直被认为是一种神经毒素,但它也可以作为ATP合成的中间代谢物,有研究者[37]分析了NCX对谷氨酸作用的影响,证实了缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)细胞中,NCX反向模式活性降低,而谷氨酸限制了这种反向模式以改善经受H/R的神经元的代谢和存活。在缺血性环境中,谷氨酸可用作心脏和大脑中的替代能源,NCX可协调谷氨酸的代谢,增强ATP供应并提高缺血细胞的活力[38]。给予钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂可通过NCX直接作用于心肌细胞,限制NLRP3炎性体激活并介导其选择性自噬,减轻心肌IRI[39]。这些发现颠覆了谷氨酸为有害因素的传统观点,未来应将注意力集中在NCX和兴奋性氨基酸转运体治疗保护靶点的研发。

质膜钙泵(plasma membrane calcium pump,PMCA)利用ATP能量主动将Ca2+自浓度低的细胞内泵出到浓度高的细胞外,故称之为钙泵[40]。对于PMCA的研究目前主要集中在神经退行性疾病中[41]。PMCA维持基础细胞溶质水平或少量Ca2+离子进入,而NCX负责调节细胞内Ca2+的大量但短暂的增加,PMCA具有高Ca2+亲和力和低容量,NCX具有低Ca2+亲和力但具有高离子流出能力,PMCA能与一些细胞中的NCX协作,以从细胞质中去除Ca2+。PMCA与IRI的相关研究较为少见,有研究称低浓度的小聚芳基化合物金复杂羧酸抑制PMCA4可显著增强血管内皮生长因子诱导的血管生成过程,体内实验证实小聚芳基化合物金复杂羧酸可增强缺血后肢体的再灌注,还有研究证明了以PMCA4为靶点进行治疗可改善缺血性心血管疾病[42]。国外学者[43]的研究表明,长时间OGD诱导后,CA1神经元中编码PMCA1和PMCA2的基因表达下调,在对细胞进行去极化诱导后,对内质网Ca2+的释放进行测量,发现咖啡因诱导的细胞内Ca2+浓度瞬变的幅度比KCl诱导的细胞内Ca2+浓度瞬变的振幅小得多,表明细胞溶质Ca2+在短暂升高后的去除是由PMCA介导的,此研究揭示了缺氧诱导因子1α驱动的PMCA上调可能是对抗海马神经元细胞内Ca2+调节缺血再灌注损伤的机制。

2 线粒体钙

线粒体是一个巨大的钙库,可缓冲大量的钙负荷。为防止细胞钙超载,线粒体有摄取和释放钙途径,2条摄取途径包括线粒体Ca2+单转运蛋白(mitochondrial calcium uniporter,MCU)单向转运和快速摄取模式,3条释放途径包括线粒体渗透性转换孔(mPTP)、线粒体Na+依赖性释放线粒体钠钙交换途径(mitochondria Na+/Ca2+exchanger,mNCX)和线粒体Na+不依赖性释放途径(mitochondria H+/Ca2+exchanger,mHCX)[44],这些钙离子进出通道在线粒体维持钙稳态中发挥重要的作用。其中,MCU、mPTP在I/R研究中较为广泛,mNCX次之。

线粒体通过不断融合和分裂保持稳态平衡,IRI会使线粒体分裂增多,过度的线粒体分裂也是造成IRI的原因。IRI期间,通过MCU积累钙是钙激活mPTP开放的主要机制,线粒体总钙增加可能是mPTP开启的触发因素,mPTP的开放代表了钙释放的快速途径,抑制MCU可减少体外心脏IRI[45-46]。线粒体电子传递失衡导致线粒体能量代谢下降在心脏缺血期间维持进行性损伤,虽然在再灌注过程中可以恢复能量代谢,但早期线粒体钙超载和ROS增加会促进mPTP的打开,导致线粒体膜电位塌陷,最终导致细胞死亡[47]。此外,线粒体上磷酸肌醇3-激酶和细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)已被证明在IRI中发挥心脏保护作用,Rameshrad等[48]使用了左前降支结扎和Langendorff法体外心脏灌注系统,证实大鼠心脏中PI3K/Akt通路的激活降低了心肌氧化应激水平并保留了线粒体功能。对小鼠模型的研究表明,成年心肌细胞MCU的急性缺失可保护心脏免受IRI和细胞死亡[49]。与此同时,过表达mNCX以增强心肌细胞细胞内Ca2+的流出或上调MCUB亚基以减弱细胞内Ca2+的摄取,可以防止IRI;在mNCX上调的情况下,即使在永久性心肌梗死后也有收缩功能[50]。此外,心脏有能力上调这种适应性蛋白,以减少IRI。因为心脏缺血损伤后,编码mNCX和MCUB亚基基因表达增加,在短期内或再灌注24 h后,MICU1的敲除会加剧I/R诱导的细胞内Ca2+超负荷,增加梗死面积和凋亡,使收缩功能受损[51],说明MICU1对MCU的门控特性在I/R中具有保护作用,终末期缺血性心力衰竭患者的MICU1转录物也升高[52]。

通过MCU过度摄取Ca2+也是导致脑组织损伤的关键因素,细胞内Ca2+对线粒体代谢的依赖性影响可以持续存在,即使细胞内Ca2+浓度的初始升高消退后,细胞能量也持续消耗。在MCAO的大鼠中,I/R导致电子传递链进行性抑制,ATP生成受损,ROS生成增加,导致神经元损伤和凋亡,缺血前药物性抑制可减弱这些变化并减少脑梗死体积,而药物性激活MCU则会加剧脑损伤[53]。成年神经元中MCU的条件性敲除同样可以保护小鼠免受缺氧缺血性脑损伤,并将神经元丢失和线粒体损伤降至最低,神经元MCU消融也可以减轻与缺氧/缺血性损伤相关的感觉运动缺陷[54]。

心脏IRI和神经元兴奋性毒性细胞死亡模型已证明MCU蛋白的表达增加,随后线粒体内Ca2+浓度升高,血液重新进入缺血组织后会产生线粒体活性氧(mROS),氧化应激刺激的mROS形成改变了线粒体分裂和融合的动态平衡,急剧升高的mROS导致mPTP开放,引发细胞凋亡和线粒体自噬,最终导致再灌注损伤。因此,MCU-mROS-mPTP轴主要调节细胞死亡途径,未来有望靶向MCU-mROS-mPTP轴减轻IRI。

3 内质网/肌浆网钙

肌浆网/内质网(sarcoplasmic reticulum/endoplasmic reticulum,SR/ER)是细胞内重要的钙储库及调控系统,胞内钙库释放大量的钙可触发钙信号。SR/ER含有一些钙调通道和受体,心肌细胞和神经元细胞中的肌醇1,4,5-三磷酸受体和雷尼丁受体(ryanodine receptor,RYR)主要介导Ca2+释放,心肌肌浆网Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase,SERCA)主要介导Ca2+储存,SR/ER中钙离子水平动态平衡才能保证钙信号的准确性。

RyR主要表达于肌细胞的肌浆网上和非肌细胞的内质网上,RyR2是广泛存在于心肌细胞SR上介导心肌兴奋收缩偶联的主要Ca2+释放通道。在心肌病、心律失常综合征和心血管再灌注损伤期间,SR上RyR2的异常表达,导致胞质Ca2+浓度增加,胞质Ca2+的增加进而导致VDAC和MCUC介导的Ca2+摄取进入线粒体,最终导致线粒体通透性转换孔开放和心肌细胞死亡。Kushnir等[55]指出,蛋白激酶A、钙调蛋白(calmodulin,CaM)和钙调蛋白激酶Ⅱ等均参与RyR2的调控,钙调蛋白激酶Ⅱ在细胞内钙超载时能够被Ca2+激活进而磷酸化RyR2,诱导RyR2开放。Bovo等[56]研究报道,IRI后的RyR氧化在β-肾上腺素能受体刺激期间从正性肌力作用到致心律失常作用的转变中至关重要,同时用还原剂巯基丙酰甘氨酸处理IRI的心肌细胞减弱了RyR氧化并降低了β-肾上腺素能受体激活过程中引起的Ca2+浓度升高。有研究者在小鼠心肌细胞中发现,RyR2与电压依赖性阴离子通道相互作用介导钙离子稳态[57],故单独或与RyR2抑制剂联合施用VDAC或MCUC抑制剂可能是一种有前景的治疗策略。

SERCA是存在于肌肉组织的肌浆网-内质网上钙泵摄取通道。心肌和骨骼肌慢肌纤维上存在较为广泛的是SERCA2a[58],SERCA2a的活性控制着胞质中Ca2+再摄取的速度和SR Ca2+贮量,是心肌生理功能的根本保证[59]。由于缺血缺氧使得ATP供给不足,SERCA2a不能将胞质中多余的Ca2+泵到肌浆网中,心肌肌浆网Ca2+-ATP酶活性下降,Ca2+转运障碍,细胞内Ca2+浓度随即升高,故SERCA2a功能低下是MIRI时心肌细胞内钙超载的重要原因之一。此外,受磷蛋白(phospholamban,PLN)作为SERCA的内源性调节因子能够抑制SERCA,Toll样受体7促进cAMP-PKA-PLN通路磷酸化的PLN可增强SERCA的活性,进而增加SR中Ca2+摄取的速度,减轻细胞内钙超载,发挥心肌保护作用[60]。有研究证实,SERCA过表达通过抑制钙超载、灭活黄嘌呤氧化酶和减少细胞内或线粒体ROS来恢复线粒体质量控制,外源性黄嘌呤氧化酶或钙通道激动剂的使用消除了SERCA过表达对线粒体质量控制的保护作用,并抵消了心脏微血管IRI后SERCA过表达的有益作用[61]。Li等[62]证实,SERCA的过表达通过使eNOS和ET-1之间的比值正常化显著减轻I/R诱导的管腔狭窄和血管壁水肿,SERCA过表达可以通过转录抑制粘附因子的表达逆转I/R诱导的微血管中红细胞形态学变化,SERCA维持的内皮屏障完整性降低了炎症细胞浸润心肌的可能性;此研究还发现SERCA过表达减弱了细胞内钙超载,抑制MCU的表达,并防止I/R处理的心脏微血管内皮细胞中mPTP的异常开放。有研究证实SERCA调节的钙稳态可能会影响Ripk3/PGAM5的激活[63]。

4 MAM、CRAC复合结构

线粒体相关内质网膜(mitochondria associated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)介导两个细胞器之间的双向通信,它通过一个复杂的传导通道参与钙离子从SR转移到线粒体。该传导通道包括雷诺丁受体、三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor,IP3R)、电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)、MCU等。简而言之,Ca2+通过IP3R或RyR释放,线粒体Ca2+被线粒体外膜上的VDAC摄取,后被线粒体内膜上的MCU摄取。为促进内质网和线粒体之间的钙离子交换,VDAC1还可通过GRP75与IP3R耦联[64],CypD-IP3R-GRP75-VDAC复合物主要调节MAM中的阳离子交换,这种复合物会随着其成分被抑制而减少,从而缓解线粒体Ca2+过载并使细胞免受IRI。Gomez等[65]报道了糖原合成酶激酶-3β与MAM中的IP3R通道复合体相互作用,并且抑制该激酶可降低IP3R磷酸化和SR Ca2+释放,从而减轻Ca2+超载,达到IRI的保护作用。关于PTPIP51、Cyclophilin D、GSK3β、MFN2等MAM定位蛋白在心肌IRI中的作用有较多研究,但机制仍不明确[66],有待进一步研究。

钙释放激活钙通道(calcium-release-activated calcium,CRAC)的组成和激活与钙感受器基质相互作用分子1(stromal interaction molecule1,STIM1)和钙库释放激活Ca2+通道蛋白1(calcium-release-activated-calcium channel protein 1,Orai1)密切相关。经典的钙池操纵性钙通道是由位于内质网膜上的钙离子感受器蛋白STIM1和质膜上Orail钙离子通道共同介导的。心肌细胞中STIM1是SR/ER钙离子感受器,通过感受钙库中Ca2+浓度的变化从而介导CRAC的开放。当细胞内钙库耗竭时,STIM1发生聚合向细胞膜靠近,并与Orail通道相互作用形成功能性CRAC,促使细胞外Ca2+内流,当细胞钙库充盈时,STIM1的活性降低,CRAC通道介导的钙内流减少。有报道指出,CRAC通道阻断剂GSK7975A能有效地阻断钙库耗竭引起的外Ca2+内流,降低细胞内钙超载[67],起到IRI保护作用。越来越多的文献表明,STIM和Orai蛋白与大脑和脊髓不同区域的神经元功能有关[68]。大脑中CRAC通道的功能仍然存在争议,特定STIM和Orai亚型在不同神经元亚群中对Ca2+信号的表达和作用存在矛盾,目前认为,神经元中的SOCE可能是通过Orai2和STIM2之间的相互作用介导的。据报道,STIM2和Orai2 mRNA主要在小鼠大脑中表达,STIM2基因敲除小鼠表现出对缺血性中风的抵抗作用,神经元钙超载和细胞凋亡减少[69]。同样,Sun等[70]报告了STIM2介导的SOCE在通过激活CaMKⅡ维持突触后棘中的关键作用。Hartmann等[71]对小脑浦肯野神经元中缺乏STIM1的小鼠进行研究表明,在IP3介导的内质网钙释放、代谢型谷氨酸受体介导的突触传递和运动协调中需要STIM1参与。该研究组随后的一份报告显示,与Orai1和Orai3 mRNA相比,Orai2 mRNA的表达最多,并且是IP3R介导的海马神经元内储存的Ca2+释放对代谢型谷氨酸受体刺激的反应所必需的,并提示这些神经元的储存再充盈是由Orai2介导[72]。上述研究并未提供神经元中ER Ca2+或神经元内CRAC的直接测量含量,故Orai2对神经元CRAC通道组成的贡献值得进一步研究。

5 小结与展望

本文较以往研究和综述而言,从不同的细胞内和细胞间钙稳态调节结构等多方面综述了钙代谢与缺血再灌注损伤的关系,以期为临床治疗缺血再灌注损伤和钙通道拮抗剂药物开发提供借鉴。目前对钙稳态和缺血再灌注损伤发生时如何失稳态等复杂的生物学过程的理解存在不足,随着对缺血再灌注损伤认识不断加深,引发了广大研究者对钙相关知识的探讨和潜在机制的挖掘。本文总结了钙信号在心脑血管疾病中的已有发现和新出现的证据,以期引起科研人员的重视,从而深入研究钙信号在继发性灌注损伤的作用机制。