盐酸表柔比星有关物质系统适用性溶液制备方法探讨

宋丽,张家宁,车慧,何丽娟（北京协和药厂有限公司,北京 102600）

盐酸表柔比星属于广谱抗肿瘤抗生素，由意大利Farmitalia Carlo Erba公司开发，1984年12月首次在意大利上市，1998年在中国上市，在美国、日本、英国等多国均获批上市。盐酸表柔比星及其制剂注射用盐酸表柔比星收载于《中国药典》2020年版。中国药典标准有关物质项下需制备多柔比星酮、盐酸多柔比星与盐酸表柔比星的混合溶液作为系统适用性溶液。在实际工作中，我们发现该系统适用性溶液中多柔比星酮在溶液中不能完全溶解，有微量沉淀，采用超声或涡旋辅助方法均不能改善多柔比星酮的溶解。本研究针对多柔比星酮溶解特性，建立了多柔比星酮溶液的制备方法，并进行比较和优化，提出药典有关物质检测方法可能的完善方案。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Thermo U3000高效液相色谱仪，Agilent 1260高效液相色谱仪，Chromeleon 7网络版色谱工作站，ZORBAX TMS-C1柱（4.6×250mm，5µm）；Thermo Genpure Pro超纯水机。

1.2 试药 多柔比星酮对照品[1]（批号130676-201801，中国食品药品检定研究院）、多柔比星酮对照品（批号1844-074A5，TLC Pharmaceutical Standards）、盐酸表柔比星对照品（批号130560-202104，中国食品药品检定研究院）、盐酸多柔比星（批号130509-202104，中国食品药品检定研究院）、乙腈（色谱纯，Fisher）、甲醇（色谱纯，Fisher）、十二硫基硫酸钠（色谱纯，Sigma-Aldrich）、磷酸（色谱纯，阿拉丁）、二甲基亚砜（DMSO，色谱级，阿拉丁）。

2 方法与结果

2.1 《中国药典》2020年版制备方法 ①流动相：水-乙腈-甲醇-磷酸（540∶290∶170∶1）并含0.2%十二烷基硫酸钠的混合溶液为流动相。②系统适用性溶液（药典方法）：取多柔比星酮3mg、盐酸多柔比星3mg和盐酸表柔比星10mg，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中分别约含多柔比星酮30μg、盐酸多柔比星30μg与盐酸表柔比星100μg的混合溶液。

2.2 本研究方法[2]①流动相：水-乙腈-甲醇-磷酸（540∶290∶170∶1）并含0.2%十二烷基硫酸钠的混合溶液为流动相。②系统适用性溶液（本研究方法）：取多柔比星酮3mg，置10ml量瓶中，加DMSO溶解并稀释至刻度，摇匀。取盐酸多柔比星3mg和盐酸表柔比星10mg，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取上述两种溶液各5ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。③DMSO溶液：精密量取DMSO 1ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 测定 精密量取流动相、DMSO溶液、系统适用性溶液（药典方法）、系统适用性溶液（本研究方法）各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至表柔比星峰保留时间的4倍。记录两份系统适用性溶液中多柔比星酮峰、多柔比星峰和表柔比星峰的保留时间、理论板数、与相邻峰的分离度。见表1，图1-4。

表1 测定数据表

上述各色谱图中，多柔比星酮峰、多柔比星峰、表柔比星峰与相邻峰之间的分离度均大于1.5，两份溶液的色谱图中各峰的保留时间基本一致，理论板数均大于2000。表明使用DMSO制备的系统适用性溶液（本研究方法）满足中国药典中盐酸表柔比星有关物质项的测定要求，对测定无干扰。

2.4 耐用性试验 精密量取流动相、DMSO溶液、系统适用性溶液（药典方法）、系统适用性溶液（本研究方法）各20μl，分别注入另一台高效液相色谱仪，记录色谱图至表柔比星峰保留时间的4倍。记录两份系统适用性溶液中多柔比星酮峰、多柔比星峰和表柔比星峰的保留时间、理论板数、与相邻峰的分离度。见表2。

表2 耐用性试验数据表

上述各色谱图中，多柔比星酮峰、多柔比星峰、表柔比星峰与相邻峰之间的分离度均大于1.5，两份溶液的色谱图中各峰的保留时间基本一致，理论板数均大于2000。表明使用DMSO制备的系统适用性溶液（本研究方法）满足中国药典中盐酸表柔比星有关物质项的测定要求，对测定无干扰。

2.5 重复性试验 精密量取系统适用性溶液（药典方法）、系统适用性溶液（本研究方法）各20μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图至表柔比星峰保留时间的4倍。记录各份溶液中多柔比星酮峰、多柔比星峰和表柔比星峰的保留时间、理论板数、与相邻峰的分离度。重复性取系统适用性溶液（药典方法）、系统适用性溶液（本研究方法）连续进样5次。见表3。

表3 精密度试验数据表

上述各色谱图中，多柔比星酮峰、多柔比星峰、表柔比星峰与相邻峰之间的分离度均大于1.5，两份溶液的色谱图中各峰的保留时间相近，理论板数均大于2000。系统适用性溶液（本研究方法）的5张色谱图中多柔比星酮峰、多柔比星峰、表柔比星峰的保留时间平均值分别为3.111min、8.301min、9.814min，RSD分别为0、0.03%、0.02%。系统适用性溶液（药典方法）的5张色谱图中多柔比星酮峰、多柔比星峰、表柔比星峰的保留时间平均值分别为3.113min、8.310min、9.820min，RSD分别为0.09%、0.03%、0.03%。两个方法各峰保留时间相对平均偏差为0.03%、0.05%、0.03%，表明使用DMSO制备的系统适用性溶液（本研究方法）满足中国药典中盐酸表柔比星有关物质项的测定要求，对测定无干扰，精密度良好。

3 讨论

3.1 本研究建立方法对不同来源多柔比星酮溶解情况的考察 目前国内的多柔比星酮对照品主要有两个来源，中国食品药品检定研究院（以下简称中检院）和TLC Pharmaceutical Standards（以下简称TLC）。其中，中检院来源的多柔比星酮为深棕色固体，未标示纯度，仅供盐酸表柔比星系统适用性试验用。TLC来源的为红褐色固体，纯度在90%以上，可用于定量测定。采用本研究方法对两个来源的多柔比星酮进行溶液制备，结果在日光灯下目视观察，两份溶液均为橙黄色澄清液体；在光照度lx1000下目视观察，溶液均澄清。表明本研究建立方法适用于不同来源的多柔比星酮。

图1 流动相色谱图

图2 DMSO溶液色谱图

图4 系统适用性溶液（本研究方法）色谱图

为了对比多柔比星酮溶解情况，我们使用《中国药典》[3]2020年版的方法对两个来源的多柔比星酮进行考察。流动相加入后，多柔比星酮没有溶解。使用超声处理35min后，在日光灯下目视观察，TLC来源的样品未观察到明显沉淀，中检院来源的样品仍能观察到少量的沉淀，静置后，TLC来源的样品溶液底部可观察到有少量的沉淀，中检院来源的样品溶液观察到沉淀增加；继续使用涡旋处理3min，在日光灯下目视观察，两个来源的样品溶液均有悬浮颗粒，中检院来源的悬浮颗粒相对明显。在实验中我们对两个来源的样品溶液过滤前后分别进样分析，同一来源的样品溶液过滤前后峰面积没有明显变化，TLC来源的多柔比星酮峰面积较中检院来源的峰面积大。两个来源的多柔比星酮溶解性能的不同应与其纯度相关。

3.2 各国药典中多柔比星酮定位方法的比较 《欧洲药典》、《美国药典》、《日本药局方》和《中国药典》2020年版均收载了盐酸表柔比星的质量标准。《中国药典》2020年版还收载注射用盐酸表柔比星的质量标准[4-5]。在有关物质项下，4部药典在检验方法和杂质控制标准上有所不同。《日本药局方》采用内标法控制杂质总量，没有对多柔比星酮的控制要求。《美国药典》和《欧洲药典》均对总杂质、其他单个杂质和多柔比星酮、多柔比星等7个杂质进行控制，其中多柔比星酮是通过对盐酸多柔比星进行酸破坏的方法获得杂质峰鉴别溶液，然后通过相对保留时间定位多柔比星酮。《中国药典》2020年版通过制备多柔比星酮、盐酸多柔比星与盐酸表柔比星的混合溶液作为系统适用性溶液进行峰定位，采用自身对照法对多柔比星酮、多柔比星、其他单个杂质和总杂质进行控制。

我们按照《美国药典》和《欧洲药典》的多柔比星酮定位溶液制备方法开展了相关试验。结果表明，制备方法操作难度不大，加入酸破坏后需要放置30min，再加入一定浓度的碱进行中和。使用HPLC进样分析，除多柔比星酮外，还检出未被破坏的多柔比星及其他被破坏的杂质，影响多柔比星酮的辨识；且相比于本研究建立的方法，操作步骤较多，不便于日常检验。

3.3 溶剂的选择 盐酸表柔比星有关物质项下流动相为水、乙腈和甲醇的混合溶液，但在前述的溶解性能考察中发现多柔比星酮无法完全溶解。单独使用水、乙腈和甲醇分别溶解多柔比星酮，均无法有效改善其溶解情况。因此需要使用其他溶解性能更好的溶剂。

查阅中国知网等数据库，未查询到相关文献中对多柔比星酮溶解性的描述。TLC来源的多柔比星酮对照品的说明书中提到，使用DMSO作为溶剂进行溶液制备，色谱峰理论板数、拖尾因子均良好。因此选择DMSO作为溶剂开展研究工作。经测试确定，采用本研究建立的DMSO溶解方法不影响有关物质检测。

3.4 制备方法的选择 在制备过程中，我们在考察本研究方法配备溶液外，同步考察使用DMSO制备溶液的其他方法。制备方法为：取多柔比星酮3mg，置100ml量瓶中，加DMSO 10ml溶解，再用流动相稀释至刻度。研究发现该方法制备的溶液在光照度lx1000下目视观察到极微量的悬浮微粒，澄清度较本研究建立的方法稍差，最终没有采纳该方法。

3.5 小结 本试验通过对《中国药典》2020年版中盐酸表柔比星的有关物质项下系统适用性溶液中多柔比星酮的溶解情况的研究，确定了合理的系统适用性溶液的制备方法，为盐酸表柔比星有关物质测定方法提供了优化方案。

建议《中国药典》2020年版中盐酸表柔比星有关物质项下系统适用性溶液修订为：取多柔比星酮3mg，置10ml量瓶中，加DMSO溶解并稀释至刻度，摇匀。取盐酸多柔比星3mg和盐酸表柔比星10mg，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取上述两种溶液各5ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。