伪三元相图联合星点设计-响应面法优选鸦胆子油微乳处方*

黄益穗，钟文嘉，刘灼波

（广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

鸦胆子油为鸦胆子药用的主要有效部位，具有清热、解毒、截疟等功效［1］及抗肿瘤、抗炎、抗医学原虫等药理作用［2］，临床可用于乳腺癌［3］、肝癌［4］、肺癌［5］等疾病的治疗。鸦胆子油具有脂溶性，口服后胃肠道不易吸收，制成水包油（O/W）型微乳，可增加其吸收性。微乳制剂为乳化剂、助乳化剂、水相、油相按一定配比经搅拌形成的澄清溶液，平均粒径为10～100 nm，是热力学稳定体系。体系由混浊变澄清为微乳由油包水（W/O）型完全转变为O/W 型即为转相，转相时2 种乳化剂的量（或含水量）即为临界点，可以目测法［6-7］测定；也可建立电导率-含水量曲线［8-9］，采用渗滤电导模型（以下称电导率-含水量曲线法）［10］测定。本研究中通过测定鸦胆子油微乳的平均粒径和多分散系数（PDI），证实电导率- 含水量曲线法测定的临界点比目测法更精确，并通过绘制伪三元相图及采用星点设计-效应面法优化鸦胆子油微乳制备工艺。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Hitachi HT7700型电子显微镜（日本Hitachi公司）；Malvern Zetasizer Nano ZS90 型分析仪（英国Malvern公司）；MS603S 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；DDS-11A 型电导率仪（上海雷磁创益仪器仪表有限公司）；RO + EDI - KK - 1 型纯化水机（广州万冠制药设备有限公司）。

1.2 试药

鸦胆子油（湖北汉达飞生物科技有限公司，批号为21091401）；聚乙二醇400（PEG400）、吐温80（TW80）、油酸（OA），均购自天津市大茂化学试剂厂，批号分别为20211215，20211101，20210801；肉豆蔻酸异丙酯（IPM，上海麦克林生化科技有限公司，批号为1811858）；所有试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 微乳相临界点测定

2.1.1 处方制备

分别以鸦胆子油/OA（1∶1、1∶2，m/m），鸦胆子油/IPM（1∶1、1∶2，m/m）作为混合油相取代空白处方中OA和IPM，共得6 个处方（编号为Ⅰ- Ⅵ），详见表1。其中RH40为聚氧乙烯氢化蓖麻油。

表1 空白微乳和鸦胆子油微乳处方Tab.1 Prescriptions of blank microemulsion and Yadanziyou Oleum Bruceae microemulsion

2.1.2 方法建立

电导率- 含水量曲线法：将乳化剂和助乳化剂按比例混匀，加入油相，600 r/min 磁力搅拌10 min，获得4 g 的微乳原液；加入0.2 g 水，600 r/ min 搅拌20 s，测定电导率和含水量，记录，重复上述步骤，直至微乳含水量为80%；采用Origin 2021 软件绘制电导率- 含水量曲线，以电导率最大值对应的含水量为临界点。

目测法：同法制得4 g 微乳原液；缓慢加入水，搅拌，观察，重复上述操作，直至溶液由混浊变澄清，记录加水量，即为临界点。上述操作均由3 名实验人员独立进行，平行3次，结果取平均值。

2.1.3 结果比较

将2种方法测得临界点按表1中的5个处方重新配制微乳，各取适量，分别滴入亚甲基蓝和苏丹Ⅲ，静置，观察。结果亚甲基蓝在上述微乳中的扩散速度均大于苏丹Ⅲ，且后者在微乳表面停留几乎不扩散，表明上述微乳均为O/W 型。进一步比较微乳的粒径和PDI，结果发现，电导率- 含水量曲线法测得的临界点含水量更高，且微乳的平均粒径和PDI更小，体系更稳定，微乳已完全转变为O/W型；目测法测得的微乳尚处于W/O和O/W 双连续型，未完全转变为O/W 型［11］。比较按不同处方（Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ，Ⅵ）制备的微乳，结果油相为鸦胆子油/OA（1︰1，m/m）和鸦胆子油/IPM（1︰1，m/m）时，微乳的平均粒径和PDI均更小，体系更稳定。详见表2、图1。

图1 处方Ⅱ电导率-含水量曲线Fig.1 Conductivity-water content curve of prescription Ⅱ

表2 电导率-含水量曲线法和目测法制备结果比较Tab.2 Comparison of the determination results of conductivitywater content curve method and visual determination method

2.2 制备工艺优化

2.2.1 伪三元相图

乳化剂、助乳化剂、油相：以鸦胆子油/OA（1︰1，m/m）和鸦胆子油/ IPM（1︰1，m/m）为混合油相，RH40 和TW80 为乳化剂，1，2-丙二醇、PEG400、无水乙醇为助乳化剂。固定乳化剂和助乳化剂的比值（Km）为2，总乳化剂和油相质量比分别为9︰1、1︰9、8︰2、2︰8、7︰3、3︰7、6︰4、4︰6、5︰5，在室温下采用电导率-含水量曲线法配制微乳，计算稳定微乳处方中总乳化剂、油相、水相的占比；采用Origin 2021 软件绘制伪三元相图，详见图2（图中黑色部分为微乳区域，图3 同）。结果含油量为10%～60%（即总乳化剂和油相的质量比分别为9︰1、8︰2、7︰3、6︰4、4︰6、5︰5）时可获得稳定微乳；油相、乳化剂、助乳化剂分别为鸦胆子油/OA =（1︰1，m/m）、RH40、无水乙醇时伪三元相图微乳区域面积最大，故选定其为最优处方类型。

图2 不同配比稳定鸦胆子油微乳伪三元相图A.Yadanziyou Oleum Bruceae/IPM，TW80，absolute alcohol B.Yadanziyou Oleum Bruceae/IPM，RH40，absolute alcohol C.Yadanziyou Oleum Bruceae/OA，RH40，1，2-propanediol D.Yadanziyou Oleum Bruceae/OA，RH40，PEG400 E.Yadanziyou Oleum Bruceae/OA，RH40，absolute alcohol F.Yadanziyou Oleum Bruceae/OA，TW80，PEG400Fig.2 Pseudo-ternary phase diagram of stable Yadanziyou Oleum Bruceae microemulsion with different ratios

图3 不同Km的稳定鸦胆子油微乳伪三元相图A.Km= 1.5 B.Km = 2.5 C.Km= 3 D.Km = 3.5Fig.3 Pseudo-ternary phase diagram of stable Yadanziyou Oleum Bruceae microemulsion with different Km

Km：将处方鸦胆子油/OA = 1︰1（m/m），RH40、无水乙醇，按Km（RH40/无水乙醇）分别为1，1.5，2，2.5，3，3.5，总乳化剂和油相质量比分别为上述比例时，在室温下采用上述方法配制微乳，并绘制伪三元相图（图3）。结果，Km>3.5 或Km<1.5 时，配制的微乳易出现分层，予以剔除，故选定最大Km为3.5，最小Km为1.5。

2.2.2 星点设计-响应面试验［12］

试验设计：以鸦胆子油用量（因素A，%）、Km（因素B）为考察因素，平均粒径、PDI为评价指标，采用星点设计-响应面法进行工艺优化；以含油量为10%～60%，鸦胆子油与OA的质量比1︰1计算，鸦胆子油的实际用量为5%～30%。因素与水平见表3。采用Design-Expert 12.0软件进行试验设计与结果分析（表4）。

表3 因素与水平Tab.3 Factors and their levels

表4 星点设计-响应面试验设计与结果Tab.4 Design and results of the CCD-RSM

模型拟合：采用Design-Expert 12.0软件求得拟合方程Y平均粒径=27.278+16.661A-2.866B-1.583AB+3.829A2+ 1.606B2，YPDI= 0.087 + 0.050A- 0.011B-0.007AB+ 0.023A2+ 0.010B2，精确度均小于10%，提示真实度和可信度均较高［13］。

方差分析：对2 个模型的回归参数进行方差分析，结果见表5 和表6，获得的平均粒径、PDI 的模型极显著（P< 0.000 1），失拟项不显著（P> 0.05），提示上述模型对真实情况的模拟较准确［14-15］。

表5 平均粒径的方差分析结果Tab.5 Results of the ANOVA of average particle size

表6 PDI的方差分析结果Tab.6 Results of the ANOVA of PDI

效应面分析：采用Design-Expert 12.0软件分析试验结果，得平均粒径、PDI 与各因素交互作用的三维响应面图（图4）。

图4 平均粒径、PDI与各因素交互作用的三维响应面图a.Average particle size b.PDIFig.4 Three-dimensional response surface diagram of the interaction of average particle size，PDI with various factors

验证试验：验证最优工艺，平行3次，结果与预测值（平均粒径为14.19 nm，PDI为0.063）接近，RSD分别为1.14%和5.64%（n= 3）。详见表7。故鸦胆子油微乳最优制备工艺为油相（鸦胆子油8.66%、OA 8.66%）占比为17.32%，乳化剂（RH40）占比为60.81%，助乳化剂（无水乙醇）占比为21.87%，含水量为71.01%。在此工艺下制得的微乳平均粒径最小。

表7 工艺验证结果（n=3）Tab.7 Results of the verification test of process（n=3）

2.3 理化性质考察

电镜图：取“验证试验”项下制得的微乳适量，滴至有支持膜覆盖的铜网上，静置15 min；用滤纸吸干，滴入2%磷钨酸负染，静置10 min；用滤纸吸干剩余液体，将样品置生物透射电镜下观察。结果显示，微乳外观圆润、规整，色泽均一。详见图5。

图5 鸦胆子油微乳电镜图Fig.5 Image of electron-microscopy of Yadanziyou Oleum Bruceae microemulsion

类型鉴别［16］：取上述微乳适量，分别滴加10 滴亚甲基蓝和苏丹Ⅲ，静置30 min。结果亚甲基蓝几乎在整个鸦胆子油微乳体系中扩散，苏丹Ⅲ几乎不扩散，表明该微乳为O/W型。详见图6。

图6 鸦胆子油微乳类型鉴别图Fig.6 Identification of type of Yadanziyou Oleum Bruceae micro⁃emulsion

高速离心：取上述微乳适量，5 000 r/min离心30 min，结果微乳澄清透明、未出现分层，表明鸦胆子油微乳稳定性良好。

室温静置：取上述微乳适量，室温下静置，分别于第30，60 天取出。测得微乳的平均粒径分别为（14.63±0.07）nm 和（15.38 ± 0.13）nm，PDI 分别为0.064 ±0.005 和0.068 ± 0.008，表明鸦胆子油微乳稳定性良好。

3 讨论

本研究中所得伪三元相图中的微乳区域偏小，原因为，1）与目测法相比，电导率-含水量曲线法测定的O/ W 型微乳临界点含水量更高，微乳区域变窄。2）部分微乳出现假阳性，即刚配制出来，外观澄清透明，测得平均粒径为10～100 nm，静置24 h 后体系变混浊。主要由于乳化剂、助乳化剂和油相类型或占比不匹配，或油相占比高，乳化剂、助乳化剂不能将其完全包裹，造成微乳粒径偏大，稳定性一般，长时间静置后，粒子间重新聚集形成胶束，导致体系变混浊。3）油相占比过低，乳化剂、助乳化剂占比过高，多余的乳化剂、助乳化剂不能完全溶于水，飘浮在液面出现分层，不能形成稳定微乳。

综上所述，本研究中优化的工艺操作简便，结果稳定可靠，可为鸦胆子油微乳的工业化生产提供借鉴。