PAMs 免疫粘附受体CR1-like 对PRRSV 感染的影响

张峥，孙雨晨，范阔海，孙娜，孙盼盼，孙耀贵，李宏全，尹伟*

（1.山西农业大学 动物医学学院 中兽医药现代化山西省重点实验室，山西 晋中 030801；2.山西农业大学 实验动物管理中心，山西 晋中 030801）

猪繁殖与呼吸障碍综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）引起的一种以呼吸道症状和高死亡率为特征的动物病毒性传染病，对世界范围的养猪产业造成了严重的经济损失［1］。山西省2016 年9 月-2019 年1 月流行病学调查显示已免疫PRRS 灭活疫苗的8 个规模化养猪场的6518份血清的PRRSV 抗体检测结果中，阳性率为82.62%，说明山西省PRRS 总体免疫效果并不理想，存在PRRSV 的反复感染［2］。PRRSV 疫苗无法对高遗传多样性的毒株提供完全的保护，PRRS 仍是持续威胁我省乃至全国养猪业的重要猪病毒性疾病之一［3-6］。

猪感染PRRSV 后以出现免疫抑制为特点，常与其他猪病混合感染或者继发感染，给养殖户造成较大经济损失的同时也给猪病的治疗增加了难度。疫苗免疫仍是预防PRRS 的最重要措施之一。用于预防PRRS 的疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗，灭活疫苗的主要劣势是免疫效果差，而弱毒疫苗免疫效果虽然优于灭活疫苗，但其安全性差，存在散毒的风险［7-8］。此外，由于PRRSV 变异快、易发生基因重组等原因，传统的疫苗仍不能有效控制PRRSV的感染［9］。PRRSV 感染初期也会诱发机体很强的体液免疫反应，一般于感染后7～9 d 可检测到特异性抗体，但这些抗体对PRRSV 都没有中和能力甚至能加强感染，而有效的中和抗体一般出现于28 d以后［10］。Yoon 等［11］学者研究发现PRRSV 感染早期产生的抗体不仅不能有效阻止病毒感染，反而导致PRRSV 在宿主细胞内复制增强，即PRRSV 的抗体依赖性增强（Antibody-dependent enhancement，ADE）现象。进一步研究发现，低中和抗PRRSV 血清与病毒形成PRRSV-抗体复合物，该复合物进一步与借助宿主细胞PAMs 表面的Fc 受体（Fc receptor， FcR）与PAMs 结合，从而促进病毒更容易进入细胞，进行有效复制并引起感染，病毒抗体在亚中和滴度水平增强了病毒感染［12］。

补体受体广泛分布于红细胞、巨噬细胞等表面，能够与补体中的活性成分发生结合，是机体重要的先天免疫功能分子［13］，其中研究较多的是I 型补体受体，其可以结合补体C3 活化产生的片段C3b。外源性病原进入血液后，血清补体被活化产生多种活性片段。其中，C3b 能够结合在病原体表面使病原致敏，补体受体通过结合C3b 将致敏病原或其抗原抗体复合物发生免疫粘附，并进一步促进病毒［14-16］、细菌［17-18］和寄生虫［19-20］的清除。但是，某些病原体也能利用补体受体来逃避识别和清除。Cardosa 等［21］研究证实补体受体-3（Complement receptor 3， CR3）可以介导小鼠巨噬细胞中西尼罗河病毒（West nile virus， WNV）的补体依赖性感染增强。人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus， HIV）也被证实能够通过补体受体进行补体介导的抗体依赖性感染增强［22］。研究发现，利什曼原虫（Leishmania spp.）同样能够以CR3 介导的方式进入宿主巨噬细胞并生存下来，并且由CR3 介导的信号可以降低巨噬细胞中白细胞介素12（Interleukin-12， IL-12）的产生［23］。本课题组前期试验结果证实猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophages， PAMs）膜表面存在猪I 型补体受体（Porcine complement receptor 1-like， CR1-like）基因，在FcR、CR1-like 共同介导下，PAMs能够移除猪红细胞免疫粘附的免疫复合物［24-25］。且猪红细胞类Ⅰ型补体受体（Erythrocyte complement receptor type 1-like， ECR1-like）通过其免疫粘附功能促进了PAMs 对致敏基因工程菌（GFP-Escherichia coli，GFP-E. coli）的捕获［26］。然而，机体针对PRRSV的免疫应答中，PAMs 免疫粘附受体CR1-like 的功能尚不明确。因此，本研究通过对PAMs 捕获病毒的拷贝数进行分析，深入探究猪新鲜血清和CR1-like对PRRSV 感染PAMs的影响，以期为CR1-like在PRRSV 免疫应答中的生物学功能研究提供理论数据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

30 日龄临床健康断奶长白仔猪（PRRSV 抗体检测为阴性），购自太谷区吴家堡养猪场；TCID50为10-5.55的PRRSV 分离株（JS-1 株，由江苏省农业科学院馈赠），本实验室冻存。鼠抗猪CR1-like 单克隆 抗 体 由 本 实 验 室 自 制 ，专 利 号 ：ZL201410308534.0，CD16、CD64、CD32 单克隆抗体均购自赛默飞有限公司，TRIzol 和Primer-ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 购自宝日医生物技术有限公司，RPMI-1640 培养基购自北京索莱宝科技有限公司，PRRSV 抗体检测试剂盒购自武汉科前生物股份有限公司，2×SYBR Green Low ROX qRT-PCR Master Mix 购自上海Bimake 有限公司，猪补体片段3b（C3b）、猪补体片段4b（C4b）ELISA 试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司，猪血清总补体（CH50）ELISA 试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

本研究中的实验动物及涉及的试验方法已获得山西农业大学实验动物伦理委员会的批准（批准号：SXAU-ASVM-16019）。

1.2 试验方法

1.2.1 抗PRRSV 血清制备及中和抗体效价检测

（1） 猪新鲜血清和抗PRRSV 血清的制备

猪新鲜血清制备：长白仔猪前腔静脉采血2000 r·min-1离心5 min，收集血清，备用。抗PRRSV 血清制备：于猪耳后部肌肉注射1 mL 高致病性蓝耳病弱毒活疫苗，接种后20～28 d 前腔静脉采血，2000 r·min-1离心5 min，取上清备用。

（2） 抗PRRSV 血清中和抗体效价的测定

PAMs的分离与原代培养等操作参照课题组前期的试验方法进行，采用固定病毒稀释血清法测定中和抗体效价［27-28］。抗PRRSV 血清800 μL 于56 ℃水浴中作用30 min，3000 r·min-1离心5 min 离心去除杂质，倍比稀释抗PRRSV 血清，稀释度依次为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256。取各稀释度抗PRRSV 血清与病毒混合悬液100 μL，37 ℃水浴1 h，作为待检血清组，依次接种于96 孔板中。取浓度为200 TCID50/100 μL 的PRRSV 悬液接种孔板中，作为病毒对照组。取抗PRRSV 血清400 μL，以400 μL 培养基进行1∶2 稀释。将1∶2 稀释的抗PRRSV 血清接种孔板中，作为抗PRRSV 血清毒性对照组。37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h，显微镜下观察病变，根据Reed-Muench 公式进行计算。

1.2.2 抗PRRSV 血清影响PRRSV 感染PAMs的检测

根据上述测定的中和效价结果，将抗PRRSV血清稀释为1∶2、1∶5.37、1∶10、1∶20、1∶40 等5 个梯度。将PAMs 接种于6 孔板中，培养12 h，PRRSV悬液1000 倍稀释后进行接种，每孔50 μL。感染9 h后，将5 个稀释度的抗血清依次加入，于37 ℃、5%CO2条件下培养，分别于12、24、36 和48 h 收集细胞样品。使用TRIzol 法提取细胞总RNA，以合成的cDNA 为模板，制备标准曲线并测定各组PRRSVN基因拷贝数。引物由北京擎科生物技术有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列及PCR 产物大小Table 1 Primer sequences and the size of PCR products

1.2.3 猪新鲜血清影响PRRSV 感染 PAMs的检测

（1） 猪新鲜血清C3b 活性、C4b 活性、CH50 总活性ELISA 测定

采集猪新鲜血清置于金属浴56 ℃，30 min 作灭活处理。将PAMs 复苏至6 孔板中，每孔加入PRRSV 悬液50 μL 感染9 h。各孔加入1∶20 稀释抗血清220 μL 和猪新鲜血清128.7 μL，分别于0、1、3、

5、36、72 h 收集各孔培养上清40 μL，检测不同时间点培养上清中各指标活性。

主要步骤如下：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品加样50 μL，待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，再加待测样品10μL。每孔加入酶标试剂100 μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃温育1 h。静置30 s 弃去，洗涤液洗5 次，拍干。每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，混匀，37 ℃避光显色10 min。每孔加终止液50 μL，终止反应。以空白孔调零，450 nm 波长依序测量各孔的吸光度。

（2） qRT-PCR 检测PRRSV N 基因拷贝数

试验分为6 组，分别记为A、B、C、D、E、F 组，各组处理如下：

A 组，PAMs 接种6 孔板中，PRRSV 悬液50 μL感染9 h 后，加入1∶20 稀释抗血清220 μL 和猪新鲜血清128.7 μL，猪新鲜血清初浓度为5%［23］，间隔3 h重复加入猪新鲜血清128.7 μL；B 组中以PBS 代替1∶20 稀释抗血清，C 组中以灭活血清代替猪新鲜血清，D 组中以PBS 代替猪新鲜血清，E 组中仅加入1∶20 稀释抗血清，F 组中仅加入PBS，B～F 组其余操作同A 组，各组处理见表2所示。

表2 试验分组及处理Table 2 Experimental groups and treatments

本试验中以加入抗PRRSV 血清和猪新鲜血清3 h 后开始计算时间，分别于0、12、24、36、48、60、72 h 后收集各组细胞样品与细胞培养上清，分别提取胞内和上清中的RNA，以qRT-PCR 检测胞内与上清中PRRSV 的拷贝数。

1.2.4 CR1-like 影响PRRSV 感染PAMs 的检测

试验分为6 组，分别记为a、b、c、d、e、f 组，各组处理见表3。

表3 试验设计及组别Table 3 Experimental design and groups

其中，CD16、CD32、CD64 单抗（终浓度均为1∶1000），CR1-like 单抗（终浓度1∶50）处理需37 ℃孵育2 h，接种PRRSV 悬液，添加各类血清操作方法同1.2.3 中（2）。以加入抗PRRSV 血清和猪新鲜血清3 h 后开始计算时间，分别于0、12、24、36、48、60、72 h 后收集a 组～f 组细胞样品，提取样品中RNA，qRT-PCR 检测PAMs中病毒的拷贝数。

1.2.5 数据分析

所有数据均以Mean±SD 表示，运用Graph-Pad PrismTM 8 软件对数据进行One-way ANOVA、Two-way ANOVA 统计分析。P＜0.05 表示有显著差异性，P＜0.01表示有极显著差异性。

2 结果与分析

2.1 抗PRRSV 血清中和抗体效价在PAMs 上的检测

将倍比稀释的抗PRRSV 血清与PRRSV 的混合液作用于PAMs 48 h 后每组细胞病变情况记录如表4所示，按公式计算得出抗PRRSV 血清中和抗体效价为1∶5.37。

表4 抗PRRSV 血清中和抗体效价检测结果Table 4 Detection results of neutralizing antibody titer in anti-PRRSV serum

2.2 抗PRRSV 血清对PRRSV 感染PAMs 的影响

分别于12、24、36、48 h 时间点收集单独PRRSV 组、1∶2 稀释度抗血清组、1∶5.37 稀释抗血清组、1∶10 稀释度抗血清组、1∶20 稀释度抗血清组和1∶40 稀释度抗血清组的细胞样品，经qRT-PCR检测PRRSVN基因拷贝数，检测结果显示：各时间点下，不同倍比稀释的抗PRRSV 血清组分别与单独PRRSV 组相比，1∶5.37 稀释度的抗血清组PRRSV 拷贝数显著低于PRRSV 组（P＜0.01），表明1∶5.37 稀释度的抗血清能够明显抑制病毒复制；12 h 与48 h 时，1∶20 稀释度的抗血清组与单独病毒组相比，其基因拷贝数高于单独病毒组，差异极显著（P＜0.01）；1∶20 稀释度的抗血清组与1∶2、1∶10、1∶40 稀释度的抗PRRSV 血清组相比，其病毒拷贝数高于各组，差异极显著（P＜0.01）。根据上述结果并结合时间动态趋势，1∶20 稀释度的抗血清对PRRSV 感染PAMs 的促进作用明显，因此选择1∶20 稀释度的抗PRRSV 血清进行后续试验（图1）。

图1 不同稀释度抗PRRSV 血清对PRRSV 感染PAMs 的影响Fig.1 Effects of different dilutions of anti-PRRSV serum on PRRSV infection in PAMs

2.3 ELISA 检测猪新鲜血清C3b 活性、C4b 活性、CH50 总活性变化

按照方法1.2.3 中（1）将PRRSV 悬液感染PAMs 9 h 后加入猪新鲜血清128.7 μL，由图2 可见，猪新鲜血清C3b、C4b 和CH50 浓度随PRRSV感染时间的延长呈降低趋势。根据各血清补体活性片段浓度的变化，本试验确定每3 h 补充猪新鲜血清128.7 μL。

图2 PRRSV 对猪新鲜血清C3b 活性、C4b 活性、CH50 总活性的影响Fig.2 Effects of PRRSV on the activity of C3b， C4b， and total CH50 of fresh porcine serum

2.4 猪新鲜血清对PRRSV 增殖的影响

胞内样品经qRT-PCR 检测PRRSVN基因拷贝数，如图3A 所示，经抗血清、新鲜血清处理后，除PRRSV 感染PAMs 12、24 h 时，A 组和B 组PRRSV 拷贝数均极显著高于F 组（P＜0.01）；C组、D 组和E 组在0、36、48、60、72 h 时，病毒拷贝数均低于A 组、B 组，差异极显著（P＜0.01），由此表明猪新鲜血清促进了PRRSV 的胞内增殖。

图3 猪新鲜血清对PRRSV 增殖的影响Fig.3 Effects of fresh porcine serum on PRRSV proliferation

上清样品经qRT-PCR 检测PRRSVN基因拷贝数，结果显示：在12、48、60 h 时，加有新鲜血清的B 组其病毒拷贝数均高于F 组，差异性极显著（P＜0.01）；24、48 h 时，加有新鲜血清的A 组其病毒拷贝数均高于F 组，差异极显著（P＜0.01）。12、24、48、60 h 时无新鲜血清的C、D、E 组病毒拷贝数均低于A、B 组，差异极显著（P＜0.01）；结合上述统计结果表明经新鲜血清处理后，上清液中PRRSV 拷贝数水平呈现升高的趋势（图3B）。

将细胞内、培养上清的PRRSVN基因拷贝数作总和处理，结果显示：在0、36、48、60 h 时，加有新鲜血清的A、B 组其病毒拷贝数均高于F 组，差异极显著（P＜0.01）；12、72 h 时，B 组病毒拷贝数高于F组，差异极显著（P＜0.01）；24 h时，A 组病毒拷贝数高于F 组，差异极显著（P＜0.01）；经抗血清、新鲜血清处理后，除PRRSV 感染PAMs 12 、24 h 时，A组和B 组PRRSV 拷贝数均极显著高于F 组（P＜0.01）；C 组、D 组和E 组在动态时间点中，平均拷贝数均极显著低于A 组、B 组（P＜0.01）。结合上述结果，表明经猪新鲜血清处理，PRRSV 的增殖水平升高（图3C）。

2.5 免疫粘附受体CR1-like 促进PRRSV 感染PAMs

胞内样品经qRT-PCR 检测PRRSVN基因拷贝数，结果显示（图4）：在0、12、36、72 h 时，经抗PRRSV 血清处理后的d 组其病毒拷贝数高于f 组，36 h 差异显著（P＜0.05），其余时间点差异极显著（P＜0.01）；在0、12、24、72 h 时，经CR1-like 单抗、FcR 单抗处理的e 组其拷贝数低于d 组，其中12、24 h 差异极显著（P＜0.01），0、72 h 差异显著（P＜0.05）；在0、12、60 h 时，e 组拷贝数低于仅以FcR 单抗处理的a 组，差异极显著（P＜0.01）；0、12、48 h时，a 组其病毒拷贝数高于f 组，差异极显著（P＜0.01），24、36、60、72 h 时，a 组病毒拷贝数显著低于f组（P＜0.05）；0、36、48 h 时，仅以CR1-like 单抗处理的b 组其病毒拷贝数高于f组，其中36 h 差异显著（P＜0.05），0、48 h差异极显著（P＜0.01）。

图4 CR1-like 免疫粘附功能对PRRSV 增殖的影响Fig.4 Effects of CR1-like immune adhesion function on PRRSV proliferation

3 讨论

本研究选择PRRSV 抗体检测为阴性的30 日健康龄断奶长白仔猪为试验对象，通过疫苗免疫获得抗PRRSV 血清。为了最大程度地模拟临床PRRSV 感染的实际情况，试验中先以病毒感染PAMs再加入抗血清的模式设计试验。试验首先对所收集的抗血清中和效价进行测定，并通过倍比稀释试验确定了亚中和抗体滴度（1∶20 稀释度抗血清），以保证试验检测的科学性。在此基础上，本试验将抗PRRSV 血清进行5 个梯度稀释，分别为1∶2、1∶5、1∶10、1∶20 和1∶40，通过qRT-PCR 检测12、24、36、48 h 的PRRSVN基因拷贝数变化分析亚中和抗体滴度对PRRSV-ADE 效应的影响。从结果来看，体外条件下1∶20 稀释度抗血清组的病毒拷贝数高于其它组，即该滴度下抗体与PRRSV 形成的抗原抗体复合物明显促进了PRRSV 胞内增殖；此外，除了其它亚中和滴度的抗血清也表现出了PRRSV-ADE 效应，这与已知的FcR 介导PRRSV 感染增强结果相一致［29-30］。上述结果说明本试验所建立的研究体系表现出了PRRSV-ADE现象，符合后续试验研究的要求。

CR1-like 是补体活性成分C3b 的受体，两者的结合是CR1-like 功能发挥的分子基础［31］，因此在讨论CR1-like 是否为ADE 介导因素时，首先应考虑猪新鲜血清对PRRSV-ADE 效应的影响。本试验以猪新鲜血清为C3b 来源，但是鉴于体外条件下猪新鲜血清中C3b 消耗对试验结果的影响，所以首先对猪血清活性的动态变化进行了检测，以确定试验体系中新鲜血清补充的时间点（3 h）及剂量（128.7 μL），以保证试验的精确性。PRRSV 体内感染可以局限于某些组织，易感巨噬细胞没有以较高的速度死亡，那么感染细胞的数量就会稳步下降，最终免疫反应能够清除感染。为保证体外感染条件更接近于体内感染状态，本试验选择PRRSV 感染PAMs 9 h 后，同时加入1∶20 倍稀释抗PRRSV 血清和猪新鲜血清进行细胞试验，qRT-PCR 检测0、12、36、48、60 和72 h PRRSVN基因拷贝数变化。从统计结果来看，0～72 h 动态监测期间，加入猪新鲜血清后，PRRSV 增殖表现出升高的趋势；而加入灭活血清或PBS 后，PRRSV 增殖的促进作用表现得并不明显。相比同行研究结果，本试验结果表明猪新鲜血清、1∶20 稀释度抗PRRSV 血清的存在对PRRSV 的增殖具有协同促进的作用。

在确定猪新鲜血清能够促进PRRSV 增殖的基础上，围绕“CR1-like 活性对PRRSV-ADE 效应的影响”这一问题进行试验。通过CR1-like McAb、FcR McAb（CD64、CD32、CD16）分别实现PAMs表面CR1-like、FcR 阻断以及两者的共阻断，经qRT-PCR 检测PAMs 胞内PRRSVN基因拷贝数的变化来定量分析PAMs 表面免疫粘附受体CR1-like 对PRRSV 感染的影响。从统计结果来看，PAMs 表面CR1-like、FcR 未被单抗阻断时（d 组），PRRSV 胞内增殖水平显著高于单独病毒感染对照组，且PRRSVN基因拷贝高峰出现时间早于对照组（f组），与前文结果趋势一致；同时阻断CR1-like、FcR 两类受体的活性后（e 组），PRRSV 胞内增殖水平降低，由此可推测FcR 活性、CR1-like 活性均与PRRSV 胞内增殖有关。前期已有试验表明PRRSV 通过FcR 途径促进病毒复制导致感染增强［32］，这与本试验结果一致。有研究表明，HIV、WNV、埃博拉病毒（Ebola virus， EBOV）、登革热病毒（Dengue virus， DENV）等病毒的相关研究发现亦具有ADE 特点，且病毒ADE 介导途径除了FcR介导外，还能通过补体受体途径介导［33-34］。然而PRRSV 能否通过补体受体途径促进病毒增殖未有报道。为此，本试验先将FcR 阻断，检测发现封闭FcR 且保留CR1-like 活性时，PRRSVN基因增殖水平呈现出下降的趋势。然后再将CR1-like 以单抗封闭仅保留FcR 活性时，PRRSVN基因增殖水平也呈现出下降的趋势，即CR1-like、FcR 的活性均与PRRSV-ADE 效应具有相关性。本研究认为，体系中加入抗PRRSV 血清后与PRRSV 形成抗原抗体复合物，猪新鲜血清在抗原抗体复合物的刺激下活化产生C3b 片段［35］，体系中抗原抗体复合物被C3b 致敏，PAMs 表面的CR1-like 通过C3b 与PRRSV 抗原抗体复合物结合，从而促进了PRRSV-ADE 效应的产生；当猪新鲜血清被灭活或PAMs 表面的CR1-like 被阻断后，PRRSV 抗原抗体复合物无法与PAMs 表面的CR1-like 结合，从而降低了PRRSV-ADE 效应，PRRSV 胞内拷贝数呈现下降趋势。

此外，一方面由于试验材料抗PRRSV 血清量的有限性，因此本试验尚不能确定抗血清与猪新鲜血清对PRRSV 增殖的作用两者之间的差别；第二，目前由于尚无商品化的猪补体成分缺省血清，因此具体是哪一类补体成分影响PRRSV 的增殖尚未鉴定；第三，补体活化过程是正向不可逆，试验体系中需要不断加入猪新鲜血清以补充C3b，由此导致培养板需要反复移动以及后期培养基体积过多，细胞生长状态存在不稳定性，对试验结果也可能造成影响。更重要的是，虽然本研究发现PAMs 表面的CR1-like 具有协同促进PRRSV-ADE 效应的生理作用，但是其具体的分子机理尚未明确，仍需进一步试验。

4 结论

综上所述，本研究结果表明在体外条件下，亚中和水平的抗PRRSV 血清能与PRRSV 形成抗原抗体复合物。该复合物经猪新鲜血清致敏，可与PAMs 膜表面的CR1-like 分子相互结合。在CR1-like 的介导下，PRRSV 抗原抗体复合物进入PAMs胞内并出现PRRSV 的增殖，表现出PRRSV-ADE效应。本研究为进一步阐明CR1-like在PRRSV 感染免疫应答中的生物学功能提供了科学数据，拓展了对PRRSV-ADE 效应机理的认识，为临床上PRRSV 持续性感染的有效防治提供了新的靶点策略。