谷子γ-氨基丁酸转运蛋白基因的生物学及表达特征分析

2023-06-23葛星辰李晨朱垠豪朱倩倩段明马芳芳韩渊怀王娟玲

山西农业大学学报（自然科学版） 2023年2期

葛星辰，李晨，朱垠豪，朱倩倩，段明，马芳芳，3，韩渊怀，3，王娟玲

（1.山西农业大学农学院，山西晋中 030801；2.山西农业大学实验教学中心，山西晋中 030801；3.杂粮种质创新与分子育种山西省重点实验室，山西晋中 030801；4.山西农业大学，山西太原 030031）

谷子（Setaria italica（L.） Beauv.，即foxtail millet）属一年生禾本科狗尾草属，于11500 年前在中国驯化［1］，随后成为适应印度、中国以及亚洲、北非和美洲其他干旱和半干旱地区的主要作物。谷子被誉为“五谷之首”，是我国主要的粮草兼用作物之一。它的营养价值高，富含氨基酸、维生素、胡萝卜素和防癌的健康元素硒等，具有为全人类提供营养和健康食物的潜力［2］。谷子因其耐旱、适应性强、高效、低消耗等优点，被认为是未来干旱、增温条件下重要的战略储备作物［3］。由于其在恶劣环境下的生长能力，它是非洲和亚洲许多地区的重要作物，也是包括山西在内的中国许多省份的主要粮食作物［4-7］。此外，据报道谷子的水分利用效率高于玉米、高粱和小麦［8］。谷子基因组小，生长周期短，是研究胁迫耐受性的理想模型系统和新兴的C4模式植物［9-10］。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid， GABA）是一种不参与蛋白质合成的氨基酸小分子，最早于1949 年在高等植物中鉴定出［11］。已报道在缺氧、冷害、热刺激、机械刺激、干旱和盐胁迫等环境条件下GABA 的含量有明显增加［12-14］，也有研究表明外源GABA 可以改变植物的逆境抗性。GABA 通常以自由态广泛存在于原核生物和真核生物的四碳非蛋白质氨基酸中［15］，然而它不同于其它非蛋白质氨基酸，其分布和存在具有广泛的种群特异性。γ-氨基丁酸转运体（GAT）是一种GABA 膜转运蛋白，在信号传导及物质吸收运输等方面起着非常重要的作用［16］。

在动物中，GABA 被证明是重要的传递神经信号的分子，它能通过其受体使神经细胞发生极化。在神经学中，GAT 可以维持细胞外GABA 的水平［17］，是调节抑制性神经活动的重要糖蛋白，与多种精神疾病有重要联系，分为浆膜转运体和囊泡转运体两大类［18］。在植物中，GABA 促进光合作用，抑制ROS 的产生，并激活抗氧化酶，还调节干旱胁迫下的气孔开放，调节植物的生长发育，提高植物的抗逆性，GAT 影响植物的C/N 平衡、pH 调节、氮储存和防御机制等诸多方面，近年来，在GAT、GABA对不定根生长、初生根生长和种子萌发的调控以及GABA 对胁迫的响应等方面都取得了很大的进展［19］。例如，GABA 的积累可以调节植物特定阴离子转运蛋白的活性，引起根系生长的变化，提高耐盐性。在拟南芥中只发现一个GAT，它不能运输脯氨酸，但对GABA 有很高的亲和力。内源性GABA作为一种植物信号，通过对气孔保卫细胞液泡膜负离子转运体的负调控实现对气孔开放的调节，Xu 等人以拟南芥为研究对象，证明了保卫细胞GABA 的产生可减少气孔张开和蒸腾失水，从而提高水分利用效率和抗旱性［20］。徐丽［21］以谷子为研究对象，证明了发芽可以有效提高谷子的营养价值和GABA含量，符合我国食品工业“营养、卫生、方便”的发展趋势。谷子是研究胁迫耐受性的理想模型系统和新兴的C4模式植物，但目前尚不能明确GAT在谷子生长发育过程中发挥的作用，对谷子GAT的生物学及表达特征分析可以为后续研究GAT在谷子生长发育中发挥的作用奠定一定的理论基础。

前期通过对谷子核心种质叶脉性状进行全基因组关联分析，我们在与二级叶脉密度显著相关SNP 位点上下游50 Kb 区间，筛选到一个谷子GAT（基因ID：Si7g07810）。通过生物信息学方法对谷子GAT的启动子、蛋白理化性质、在不同组织及干旱胁迫下的表达模式等进行分析，以及对该基因在豫谷1 号（简写为YG1）胁迫处理时的表达情况进行分析，为进一步研究谷子的抗逆性提供理论依据。通过对拟南芥野生型和SALK_201083C 进行抗旱研究，旨在为谷子GAT的功能提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 数据获取

利用谷子多组学数据库（http：//foxtail-millet.biocloud. net/home）下载超早熟谷子突变体“xiaomi”中Si7g07810的核酸序列及蛋白氨基酸序列［22］。从Phytozome 数据库（https：//phytozome. jgi. doe.gov/pz/portal.html）下载拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativaL.）、高粱（Sorghum bicolor（L.） Moench）、小麦（Triticum aestivumL.）、玉米（Zea maysL.）的全基因组序列、CDS 序列、蛋白序列。

1.2 谷子GAT 的生物信息学分析

1.2.1 序列特征及启动子顺式作用元件分析

选取谷子GAT核酸序列上起始密码子上游2000 bp 长度的序列作为启动子顺式作用元件分析区域。将其输入到PlantCARE 在线软件（http：//bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html）中得到基因上游2000 bp长度的核酸序列上所有的顺式作用元件，并进行分析。

1.2.2 谷子GAT的基本信息和理化性质分析

利用ExPASY-ProtParam 在线软件（https：//web. expasy. org/protparam/）对谷子GAT的氨基酸数目、等电点和分子量等理化性质进行统计分析。

1.2.3 谷子GAT 基因的信号肽、跨膜结构及亚

细胞的分析与预测

利用SignalP 蛋白信号肽在线预测工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对谷子GAT 基因信号肽进行预测，使用TMHMM 在线软件（http：//www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM）对谷子GAT 基因进行跨膜结构预测分析，通过PSORT Prediction（http：//psort1.hgc.jp/form.html）对谷子GAT 基因序列进行亚细胞定位预测［23］。

1.2.4 谷子GAT基因的二级结构及三级结构分析

使用SOPMA 在线软件和SWISS-MODEL（https：//swissmodel. expasy. org/interactive）对蛋白质二级结构与三级结构进行预测。

1.2.5 谷子GAT与拟南芥、水稻、高粱、小麦、玉米中

同源基因进化树构建，及基因结构域分析

通过TBtools 分别在拟南芥、水稻、高粱、小麦、玉米总蛋白序列中寻找谷子GAT的同源基因，从Phytozome 数据库找到同源基因的蛋白序列，利用MEGA 7.0 软件进行氨基酸序列聚类和进化分析，采用邻接法（Neighbor-Joining， NJ）构建系统进化树，遗传距离为泊松距离（poisson correction），抽样次数为1000（bootstrap：1000 replications）。其它参数选择默认。

1.2.6 谷子GAT在谷子各个时期及器官表达分析

利用山西农业大学杂粮分子育种团队的谷子多组学数据库（http：//foxtail-millet. biocloud. net/home）查找该基因在晋谷21（简写为JG21）和“xiaomi”中各个时期及器官表达情况，并进行分析。

1.3 植物材料获取

拟南芥（Arabidopsis thaliana）：Columbia 生态型种子，由本实验室继代种植培养所得。从AraShare 网站购买GAT拟南芥同源基因At5g41800的T-DNA 插入突变体SALK_201083C（简称为gat）。

1.4 拟南芥培养

将拟南芥种子分装在1.5 mL 的尖头离心管中，用无菌蒸馏水清洗3 次，加入1 mL70%无水乙醇振荡消毒1 min，用无菌蒸馏水清洗2 次，加入1 mL15%次氯酸钠溶液振荡消毒30 min，用无菌蒸馏水洗2 次，置于灭菌滤纸上吹干，用灭菌牙签均匀播种于1/2MS 培养基上。4 ℃放置2～3 d 后转移至16 h（昼）/8 h（夜）、15 000 Lx、25 ℃条件下生长，14 d后将拟南芥幼苗移栽到混合基质（营养土：蛭石=1∶1）中继续培养1～5周［24］。

1.5 gat 纯合突变体DNA 水平的鉴定

将1/2MS 培养基上生长14 d 的野生型和gat突变体拟南芥幼苗移栽到混合基质中，待植株生长至开花期时分别对叶片进行单株取材，用CTAB 法提取DNA。根据网站（http：//signal.salk.edu/）获得T-DNA 插入拟南芥株系鉴定引物，将纯合阳性株系继续培养至籽粒成熟并收获。

SALK_201083-LP 和SALK_201083-RP 与LBb1.3 组合，利用三引物法鉴定gat纯合突变体，引物序列见表1。PCR 反应体系包括1 μL 模板，3条引物各0.25 μL，2×PCR Mix 5 μL，用ddH2O 补足至10 μL。扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸15 s，循环30 次；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。将纯合阳性株系继续培养至籽粒成熟并收获，扩繁保存备用。

1.6 模拟胁迫处理下gat 种子发芽率和根发育情况统计分析

将野生型和gat拟南芥种子分别种植于1/2MS、200 mmol·L-1甘露醇以及100 mmol·L-1Na-Cl 培养基中进行培养，对种子8 d 内的萌发情况进行统计。将野生型和gat拟南芥种植于正常1/2MS培养基中，待种子发芽后，挑选长势一致的幼苗分别都移种于新的1/2MS、200 mmol·L-1甘露醇、100 mmol·L-1NaCl 培养基中，14 d 后观察根的生长发育情况。

1.7 gat 表型鉴定

将1/2MS 培养基上培养14 d 的gat拟南芥株系幼苗移栽到营养土中（基质∶蛭石=1∶1），保证水肥充足健康生长，相较野生型观察表型变化。

1.8 谷子GAT 实时荧光定量PCR

将YG1 种子用清水浸泡2 d 后移栽至营养土（营养土∶蛭石=3∶1）培养4 周（28 ℃光照16 h，25 ℃黑暗8 h，相对湿度50%）。幼苗分别进行15%PEG-6000 溶液、200 mmol·L-1NaCl 溶液胁迫处理，并在处理后0、0.5、1、2、4、6、12 h 等不同时间段分别取样，用液氮迅速冷冻，于-80 ℃冰箱保存。

将-80 ℃保存的谷子材料放在预冷的研钵上加入液氮速冻，并开始研磨，在液氮将要挥发完时，再往研钵中加入液氮继续研磨，反复3 次直至叶片被研磨成粉末，迅速将植物粉末加入到装有1 mL Trizol 裂解液的1.5 mL 离心管中，旋涡震荡混匀，以彻底裂解细胞，静置5 min；4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液加入到装有0.2 mL 氯仿的新离心管，上下颠倒混匀，静置5 min，4 ℃，12 000 r·min-1离心15 min；取上层上清液装入到有等体积异丙醇新离心管中，上下颠倒混匀，室温条件静置10 min；4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，在离心管底部看到白色RNA 沉淀；弃上清，加1 mL75%乙醇清洗残留的试剂及蛋白质，4 ℃，12 000 r·min-1离心1 min；弃上清，将沉淀的RNA 样品在超净中风干沉淀，加入20 μL 的RNA-free ddH2O 溶解RNA，得到RNA样品。提取的RNA 利用TaKaRa 反转录试剂盒进行反转，反转完成的cDNA 稀释10 倍放入-20℃保存［25］。

以上述合成的cDNA 为模板，采用三步法qRT-PCR。利用2-△△Ct法根据各样品在特定荧光阈值下的Ct 值计算基因在不同样品中的相对表达量。使用DNAMAN 软件设计谷子GAT的引物，引物如表2所示。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

2 结果与分析

2.1 谷子GAT 的生物信息学分析

2.1.1 序列特征及启动子顺式作用元件分析

选取谷子GAT起始密码子上游2000 bp 的序列进行启动子顺式作用元件分析。如表3 所示，谷子GAT包含很多类型的启动子元件，如光响应元件、赤霉素反应元件、脱落酸响应元件、参与分生组织表达相关的顺势作用元件、无氧诱导响应元件等。

表3 谷子GAT 启动子元件Table 3 Promoter element of foxtail millet GAT

2.1.2 谷子GAT的基本信息和理化性质分析

从表4 可见，谷子GAT的cDNA 序列所编码拥有452 个氨基酸组成的蛋白序列，氨基酸的种类为20 种，其中氨基酸Ala、Leu、Val 的数量较多分别占总氨基酸数量的14.8%、12.6%和11.1%，没有氨基酸Pyl 和Sec。化学分子式为C2185H3489N573O593S20，分子量为47 915.42 Da，理论等电点为9.66，呈碱性。脂肪系数（aliphatic index）为114.2，不稳定系数（instability index）为43.52＞40，说明蛋白属于不稳定蛋白，稳定性较差。蛋白总平均亲水性指数（grand average of hydropathicity， GRAVY）为0.654，属于疏水性蛋白。

表4 谷子GAT 基因组分和理化性质Table 4 Composition and physicochemical properties of GAT gene in foxtail millet

2.1.3 谷子GAT 基因信号肽、跨膜结构及亚细胞的分析与预测

使用SignalP 分析工具预测谷子GAT 基因的信号肽，结果表明该蛋白不含有信号肽。使用TMHMM 工具对谷子GAT 基因进行跨膜结构分析，结果如图1 所示，可以看出整个蛋白序列预测出了10 个跨膜螺旋结构域，这与它跨膜转运蛋白的功能相对应。通过使用PSORT Prediction 在线分析工具对该蛋白进行细胞内定位分析，结果发现谷子GAT 基因主要分布在叶绿体类囊体膜和质膜上，在高尔基体和内质网膜上也有分布。

图1 谷子GAT 基因的跨膜结构Fig.1 Transmembrane structure of GAT gene in foxtail millet

2.1.4 谷子GAT基因的二级结构及三级结构分析

运用SOMPA 对蛋白的二级结构进行分析，结果如图2。从图中可以看出谷子GAT 基因的二级结构由28.54%的无规则卷曲、44.47%的α-螺旋、7.08%的β-折叠和19.91%的延伸链组成。利用SWISS-MODEL 对蛋白三级结构基因分析如图3，发现谷子GAT 基因三级结构中不存在转角结构。

图2 谷子GAT 基因的二级结构Fig.2 Secondary structure of GAT gene in foxtail millet

图3 谷子GAT 基因的三级结构Fig.3 Tertiary structure of GAT gene in foxtail millet

2.1.5 谷子GAT与拟南芥、水稻、高粱、小麦、玉米中同源基因进化树构建，及基因结构域分析

从图4 构建的同源进化树观察可以发现，自展值都很高，自展值可以显示可信度说明进化树可信度也很高，同时也发现谷子GAT与水稻基因LOCOs05g50920.1亲缘关系更近。从图5 可以看出谷子GAT与其他同源基因都含有一个SLC5-6-like_sbd superfamily 保守结构域。

图4 6 个物种GAT 基因的同源进化树比对Fig.4 Homologous phylogenetic tree comparison of GAT genes in six species

图5 谷子GAT及同源基因的SLC5-6-like_sbd superfamily结构域Fig.5 SLC5-6-like_sbd superfamily domain of GAT in foxtail millet and its homologous genes

2.1.6 谷子GAT在各个时期及器官表达分析

从图6 可以看出，谷子GAT在根、茎、叶、种子中都有不同程度的表达，在灌浆期的根中表达量最高，在S3 时期的叶脉中也有较高的表达，另外，在萌发的种子、两叶一心期的植株以及灌浆期的叶鞘当中也有表达，但其他时期的组织中表达量都很低。

图6 谷子GAT 表达分析（图片和数据引用自山西农业大学杂粮分子育种团队的谷子多组学数据库）Fig.6 Expression of GAT in foxtail millet （The pictures and data are quoted from the millet multiomics database of the molecular breeding team of Shanxi Agricultural University）

2.2 鉴定gat 纯合突变体

基因功能的鉴定与研究离不开转基因植株和突变体。我们首先利用拟南芥突变体对GAT进行相关研究，后期将通过基因编辑对谷子GAT进行系统性研究。

在Signal 网站上查找突变体特异引物，用三引物法对提取的拟南芥突变体植物的DNA 进行PCR扩增（图7），野生型植株扩增产物为1100 bp 左右的单一条带；纯合突变体植株扩增产物为560 bp 左右的条带；若是杂合，突变体植株扩增产物为560 bp和1100 bp 左右两条条带。经PCR 检测获得了一个纯合缺失突变体株系，记为gat，将纯合突变体收种，扩繁保存备用。

图7 突变体DNA 水平鉴定结果Fig.7 Identification results of mutant DNA levels

2.3 模拟胁迫处理下发芽率和根发育情况统计分析

从图8 可以看出，在正常的1/2MS 培养基上野生型和gat突变体拟南芥的种子在种植第3 天的发芽率都接近100%，说明种子正常。在100 mmol·L-1甘露醇培养基上，8 d 的发育过程中突变体的发芽率均低于野生型；在100 mmol·L-1NaCl培养基上，第1、2 天突变体的发芽率接近野生型，第3到8天突变体的发芽率低于野生型。

图8 100 mmol·L-1甘露醇与100 mmol·L-1NaCl 胁迫处理下gat 种子发芽率Fig.8 Germination rate of gat seeds under 100 mmol·L-1 mannitol and 100 mmol·L-1 NaCl stress treatments

野生型和gat突变体拟南芥种子在1/2MS 培养基培养的第3 天种子大部分都发芽，挑选长势一致的幼苗分别移种新的1/2MS、浓度分别为100 mmol·L-1甘露醇和100 mmol·L-1NaCl培养基中，14天后观察它们根的生长状况，结果如图9 所示。在1/2MS 和100 mmol·L-1NaCl 培养基中，野生型和gat突变体拟南芥的根长差异不显著，100 mmol·L-1甘露醇中，突变体的根系较野生型显著变短。

图9 100 mmol·L-1甘露醇与100 mmol·L-1NaCl 胁迫处理下gat 根发育Fig.9 gat root development under 100 mmol·L-1 mannitol and 100 mmol·L-1 NaCl stress treatments

2.4 突变体拟南芥表型鉴定

将1/2MS 培养基上生长14 d 的野生型和gat突变体拟南芥植株移栽到吸饱水的营养土中，继续生长2 周后进行自然干旱处理。从图10a 中可以看出，干旱处理12 d 后gat突变体较野生型表现出弱的耐旱性，叶片大部分变黄，萎蔫程度高。比较正常条件下生长的野生型和gat突变体拟南芥，如图10b 和10c，gat突变体拟南芥较野生型的株高变低，抽薹和开花时间提前。

图10 拟南芥表型鉴定Fig.10 Phenotypic identification of Arabidopsis Thaliana

对比正常条件下生长的野生型和gat突变体拟南芥的莲座叶和种子，从图11 中可以看出gat突变体拟南芥较野生型莲座叶数量变少，叶片变小，果荚变短，种子变小。

图11 正常条件下WT 和gat 莲座叶和种子表型鉴定Fig.11 Indus leaves and seeds phenotypic characterization of WT and gat under normal conditions

2.5 谷子GAT 在YG1 受到各种胁迫处理下的表达情况

对YG1 幼苗进行15%PEG-6000 胁迫和200 mmol·L-1NaCl 溶液胁迫处理，实时荧光定量PCR 分析基因GAT在幼苗胁迫处理后12 h内的表达情况。从图12 可以看出，在YG1 受到15%PEG-6000 胁迫处理下，在处理第1 hGAT的表达量最高，较第0 h 上调了154.6%；YG1受到200 mmol·L-1NaCl 溶液胁迫处理下，在0.5～4 hGAT表达量较第0 h 显著下降，在处理第2 h 下调了53.8%；但在处理6～12 hGAT的表达量较第0 h 上调，在处理第6 h 上调了26.0%。

图12 15%PEG-6000 与200 mmol·L-1NaCl 处理12 个小时下YG1 幼苗中GAT 表达情况Fig.12 Expression of GAT in YG1 seedlings treated with 15%PEG-6000 and 200 mmol·L-1 NaCl for 12 hours

3 讨论

GABA 是一种存在于许多生物体中的非蛋白质氨基酸。脊椎动物中，GABA 通常是作为中枢神经和外围神经系统的抑制剂；而在植物中，GABA是一种信号物质，可调节植物生长发育和抗旱生理，GAT 是一种GABA 转运蛋白，植物GAT 对C/N 平衡、pH 调节、氮储存和防御机制等方面均有影响［26-28］。本研究中对谷子GAT启动子元件分析显示其含有光响应元件、赤霉素反应元件、脱落酸响应元件、参与分生组织表达相关的顺势作用元件、无氧诱导响应元件等，并通过非生物胁迫实验进一步验证该基因确实响应逆境胁迫，这表明谷子GAT被赋予响应光照、调控内源激素和分生组织表达等潜在功能；谷子GAT 基因总平均亲水性指数为0.654，属于疏水性蛋白，这与一般转运蛋白的疏水特性相同，对谷子GAT 基因进行跨膜结构分析共预测出了10 个跨膜螺旋结构域，这与它跨膜转运蛋白的功能相对应，并且谷子GAT与其他同源基因都含有一个与跨膜转运相关SLC5-6-like_sbd superfamily 保守结构域，这表明谷子GAT 基因被赋予转运蛋白的潜在功能。但该基因在谷子中的具体功能还需要通过实验进一步验证。有研究表明，外源物质GABA 通过对水稻秧苗的生长调控，提高了盐分胁迫下秧苗的抗氧化酶活性和根系活力，维持逆境中秧苗光合作用正常进行的同时促进了同化物优先向地上部分配转运，进而提高作物水稻的耐盐能力，为盐分胁迫下水稻的稳产提供条件［29］。同源进化树分析发现谷子GAT与水稻亲缘关系更近，因此外源物质GABA 很有可能提高作物谷子的耐盐能力，但外源GABA 对谷子的调控作用尚需实验进一步验证。表达分析表明谷子GAT在根、茎、叶、种子中都有不同程度的表达，在灌浆期的根中表达量最高，在S3 时期的叶脉中也有较高的表达，另外，在萌发的种子、两叶一心期的植株以及灌浆期的叶鞘当中也有表达，但其他时期的组织中表达量都很低，说明谷子GAT在生长发育过程的不同时期和不同部位发挥着各自独特的作用。对谷子GAT在YG1 受到胁迫处理时的表达情况分析表明，15%PEG-6000 胁迫处理后第1 h 和200 mmol·L-1NaCl 溶液胁迫处理后第6 h 该基因的表达量较对照都大幅度上调，说明该基因对逆境胁迫有所响应。

对谷子GAT在拟南芥中同源基因突变体gat研究发现，在甘露醇模拟干旱胁迫和NaCl模拟盐胁迫的培养基中，gat突变体拟南芥较野生型种子发芽率有所下降，根系变短，说明了GAT在抵御干旱胁迫和盐胁迫时发挥了作用。在对拟南芥植株自然干旱处理后，gat突变体拟南芥较野生型叶片大部分变黄，萎蔫程度高；而在正常生长条件下，gat突变体拟南芥较野生型株高变低，抽薹和开花时间提前，莲座叶数量变少，叶片、果荚和种子变小，这一系列变化表明GAT在抵御干旱胁迫时发挥了重要作用［30-31］。研究结果对今后进一步研究GAT的功能提供一定理论依据。