交泰丸对复合刺激致失眠大鼠GFAP 和S100B 的影响*

郭昕子，曾雪爱，周春权，黄俊山

1 福建中医药大学中西医结合研究院 福建福州 350122

2 福建省中医药科学院 福建福州 350003

随着现代社会压力的增加，失眠患者越来越多，甚至出现许多并发症[1]，严重影响日常工作和生活。交泰丸有清上温下、安神定志的功效[2]，是治疗心肾不交型失眠的经典方，但其治疗失眠的机制尚不明确。有研究表明星形胶质细胞（astrocytes，AC）可通过调控神经网络兴奋性、调节突触可塑性[3]、释放活性分子[4]等途径参与调节中枢神经系统稳态，在睡眠-觉醒周期的调节中发挥重要作用。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是AC 的骨架蛋白，有研究表明其仅在AC 的胞体中表达，血清中GFAP 可能来源于中枢神经系统[5]。S100 钙结合蛋白B（S100 calcium-binding protein B，S100B）由AC 分泌[4]，其适度表达有利于保护受损脑部，而过度表达会加重疾病对脑部的损伤[6]。故本研究通过多因素刺激+腹腔注射对氯苯丙氨酸（para-chlorophenylalanine，PCPA）建立失眠模型，观察交泰丸对失眠大鼠血清和基底前脑GFAP 和S100B 的影响，探讨交泰丸改善失眠的作用机制。

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF 级健康雄性SD 大鼠28 只，体质量（230±10）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（沪）2017-0005，饲养于福建省中医药科学院比较医学实验中心，许可证号SYXK（闽）2016-0005，饲养环境安静，恒温（25±1）℃、相对湿度50%～60%、12/12h 明暗光照。本研究经福建省中医药科学院实验动物伦理委员会批准，批准号：FJATCM-IAEC2020022。

1.2 药品与试剂 中药饮片购自福州鹭燕药业股份有限公司；艾司唑仑（常州四药制药有限公司，批号：20180813）。PCPA（上海源叶生物科技有限公司，批号：7424-00-2）；GFAP（批 号：CSB-E 08602r）、S100B（批号：CSB-E08066r）酶联免疫检测试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司；GFAP 兔抗大鼠单克隆抗体（美国Cell Signaling TECHNOLOGY 公司，货号：80788），S100B 兔抗大鼠单克隆抗体（武汉ABclonal Technology 公司，货号：A19108）。

1.3 仪器 Sorvall Legend Micro 17R 型冷冻高速离心机（德国Thermo Fisher SCIENTIFIC 公司；Elx800TS型酶标仪（美国BioTek 公司）；蛋白电泳槽和电转仪（美国Bio-Rad公司）；FluorChem M型Alpha多色荧光、化学发光凝胶成像系统（美国ProteinSimple 公司）。

2 实验方法

2.1 失眠模型建立 28 只大鼠随机分为正常组、模型组、交泰丸组、西药组，每组7 只。正常组正常饲养，其余三组参考文献[7]方法，在腹腔注射PCPA 的基础上，采用多因素刺激共同作用制备失眠模型。所有动物每天同时接受同一种刺激，随机刺激包括以下7 种：四肢束缚2 h、4℃冰水游泳5 min、夹尾1min、禁食禁水24 h、鼠笼倾斜45°24 h、昼夜颠倒24 h、潮湿垫料24 h。采用Excel 随机数字法产生如下刺激顺序：4℃冰水游泳5min、四肢束缚2h，鼠笼倾斜45°24h、夹尾1min、潮湿垫料24h、昼夜颠倒24h、禁食禁水24h、鼠笼倾斜45° 24h、4℃冰水游泳5min、夹尾1min、禁食禁水24h、昼夜颠倒24h、四肢束缚2h、潮湿垫料24h。14d 多因素刺激结束后，除正常组外，其余三组以10 mL/（kg·d）腹腔注射3%PCPA 混悬液[300 mg/（kg·d）]，正常组腹腔注射等体积弱碱性生理盐水，1次/d，共2d。在最后一次注射PCPA 后，与正常组大鼠比较，其余组大鼠进食减少、饮水增加、毛发稀疏、易激惹、白天活动增多、昼夜节律消失，提示造模成功[7]。

2.2 给药方法 交泰丸组成：黄连10 g，肉桂1 g。给药剂量按大鼠与成人给药剂量换算[8]。药物经煎煮及过滤浓缩后获得浓度为0.11g/mL 的交泰丸药液，4℃保存。艾司唑仑片由纯净水配制为0.1mg/mL 的艾司唑仑药液，4℃保存。造模结束后交泰丸组给予交泰丸药液，西药组给予艾司唑仑药液，空白组和模型组给予蒸馏水，均以10mL/（kg·d）灌胃，1 次/d，共7d。

2.3 一般状态观察 于第16 天和第23 天观察大鼠进食量、饮水量、皮肤毛发、活动程度、精神状态、昼夜节律。

2.4 记录各组大鼠体质量变化 第16 天至第23 天每天记录大鼠体质量，给药前、后体质量增量=末次给药（第23 天）体质量 - 造模后（第16 天）体质量。

2.5 ELISA 法检测血清GFAP 和S100B 含量 各组大鼠末次给药2h 后，用2. 5%戊巴比妥钠 （50 mg/kg）腹腔注射麻醉后取腹主动脉血，室温条件下血液静置2 h 后离心（3500r/min，15min），取血清置于-80℃冰箱备用。采用ELISA 法检测血清GFAP 和S100B 含量，按照ELISA 试剂盒说明书进行实验操作。

2.6 蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测基底前脑GFAP 蛋白相对表达量 末次给药2h 后，腹主动脉采血结束立即断头，取出大鼠脑组织，冰上分离出大鼠基底前脑，基底前脑用RIPA 蛋白裂解液（含PMSF、蛋白酶抑制剂）进行裂解，4℃摇床上裂解30min，4℃下12000rpm/min 离心10min，吸取上清液获取总蛋白。用BCA 法进行蛋白定量，98℃变性蛋白10min，SDSPAGE 凝胶电泳，湿法转膜，快速封闭液封闭10min，4℃孵育一抗过夜，TBST 洗10min×3 次，室温孵育二抗1h，TBST 洗10min×3 次，曝光显影，采用Image J 软件进行灰度值分析。

3 统计学方法

采用SPSS 26.0 软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，方差齐采用LSD 检验，方差不齐者采用Games-Howell 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 一般状态观察

正常组大鼠毛发顺滑有光泽，进食量、饮水量正常，体质量增加，日间活动较少，多蜷卧，夜间活动较多，精神状态良好，昼夜节律明显。与正常组比较，模型组进食量减少、饮水量增加，大鼠毛发稀疏无光泽，白天活动增多，易激惹，昼夜节律消失。交泰丸组和西药组大鼠进食量、饮水量增加，毛发增多且恢复光泽，白天睡眠增加，夜晚活动增多，精神状态明显改善，昼夜节律恢复。

2 各组大鼠给药前、后体质量增量比较

与正常组比较，模型组体质量增加缓慢（P＜0.01）。与模型组比较，交泰丸组和西药组大鼠体质量增量差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见图1。

图1 各组大鼠给药前、后体质量增量比较

3 各组大鼠血清GFAP 及S100B 含量比较

与正常组比较，模型组大鼠血清GFAP 含量升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，交泰丸组和西药组大鼠血清GFAP 含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，模型组大鼠血清S100B 含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，交泰丸组、西药组大鼠血清S100B 含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见图2、图3。

图2 各组大鼠血清GFAP 含量比较

图3 各组大鼠血清S100B 含量比较

4 各组大鼠基底前脑GFAP、S100B 蛋白相对表达量比较

与正常组比较，模型组大鼠基底前脑GFAP、S100B 蛋白表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，交泰丸组和西药组大鼠基底前脑GFAP、S100B 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图4、图5。

图4 各组大鼠基底前脑GFAP 蛋白相对表达量比较

图5 各组大鼠基底前脑S100B 蛋白相对表达量比较

讨 论

《景岳全书》中有相关记载：“真阴精血不足，阴阳不交，而神有不安其室耳”。中医认为，人体内心肾失交，水火失调，阴阳失衡，易致失眠[9]，出现焦虑、烦躁等不良情绪。韩飞霞在《韩式医通》中提出用交泰丸治疗不寐，方由黄连和肉桂组成，黄连苦寒，归心经，泄心火以降心阳亢盛，使心火下达于肾；肉桂辛热，归心、肾经，温肾补阳以滋肾水，使肾阴上济于心。方中黄连与肉桂配伍，一阴一阳，一寒一热，一清一温，共奏交通心肾，调神定志之效。现代研究发现，黄连中的黄连碱与小檗碱[10-11]、肉桂中的肉桂醛与肉桂酸[12]可抑制中枢神经功能，有镇静催眠作用，有助于改善失眠症状。有研究[13]证实交泰丸中当黄连与肉桂药量比为10：1 时，治疗失眠的疗效最佳。

大脑不同脑区可通过多种生物学机制调控睡眠-觉醒活动，基底前脑在脑内起到传递信息的作用。基底前脑接收丘脑和脑干部位促觉醒网状上行激活系统的信息后，投射至大脑皮质[14]。有研究证实，基底前脑的胆碱能神经元可促进觉醒活动，中断基底前脑对皮质的投射后，觉醒活动就会随之消失[15]。

AC 是中枢神经系统中数量最多的神经细胞，对正常睡眠和认知功能有重要调节功能[16]，当中枢神经系统受到损伤，AC 会应激性活化、增生[17]。GFAP 作为AC 活化标志物，在中枢神经系统相关疾病发病过程中通常表现为上调趋势，表明AC 处于应激状态，即神经元受损。

研究发现，AC 还通过释放信号分子以调节神经元活动[18]。AC 可释放S100B、三磷酸腺苷、谷氨酸等神经活性分子参与调节睡眠功能[4]，S100B 经AC以旁分泌或自分泌产生，在脑损伤中发挥保护作用，但其过度表达会加重中枢神经系统损伤情况[6]，所以S100B 成为反映神经细胞损伤的另一有效指标。失眠状态下神经细胞持续兴奋，产生兴奋毒性作用，进而损伤神经细胞，S100B 的血清水平可以反应神经受损程度[19]。

课题组前期实验证实交泰丸可恢复失眠大鼠的血清ACTH 水平，并增加大鼠的睡眠总时长，改善睡眠剥夺大鼠的睡眠质量[20]。本实验结果说明在失眠过程中，基底前脑和血清中GFAP 与S100B 可能发生相应病理变化。通过多因素刺激+PCPA 复合刺激建立心失眠大鼠模型，给予交泰丸治疗进行实验，结果发现在失眠大鼠血清中GFAP、S100B 含量与基底前脑内GFAP 和S100B 蛋白相对表达显著升高，表明发生失眠时，大鼠脑神经细胞受损，AC 可能反应性增长与活化，同时应激性分泌S100B。在给予交泰丸治疗7 d 后，大鼠精神状态明显改善，体质量显著增加，昼夜节律恢复，血清及基底前脑GFAP、S100B 表达水平均显著降低，提示交泰丸有助于恢复失眠大鼠血清和基底前脑GFAP、S100B 水平，减轻大脑神经细胞的损伤，从而调节失眠大鼠的睡眠功能。

综上所述，交泰丸可能通过降低GFAP、S100B 表达水平，中断应激状态，从而稳定睡眠内环境，减轻失眠带来的中枢神经系统受损状况，因此对心肾不交型失眠有一定治疗作用。