超声辅助酶解法提取杏鲍菇多糖工艺研究

孙法林，肖慧慧，侯笑林，张玉豪

（青岛工学院食品工程学院，山东青岛 266300）

杏鲍菇富有蛋白质、碳水化合物、维生素及钙、铜、镁等矿物质，可增强人体免疫力，对人体具有抗癌、降血脂及美容养颜作用[1]。天然多糖根据来源分为微生物多糖、动物多糖和植物多糖，广泛存在动植物体内和微生物细胞壁中[2]，其作用几乎涉及到机体免疫系统的各个方面，具有降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎症等多种功效[3]。获得多糖的方法常用的有热水提取法、酸提取法、碱提取法和酶提取法等，其中酶技术是近年来广泛应用的一项生物技术，加速多糖的释放或提取[4]。

杏鲍菇多糖是杏鲍菇的主要活性成分之一，具有较高的药用价值，并且对人体有保健功能。目前，食用菌多糖的酶法提取、超声辅助提取等技术均已有报道，但酶法和超声辅助联合提取杏鲍菇多糖研究报道较少。在基于超声处理作为基础，采用纤维素酶法提取杏鲍菇多糖，进一步改善了提取工艺，为杏鲍菇下一步利用提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 原材料

杏鲍菇，当地超市采购，要求新鲜、无腐烂。

1.1.2 试验试剂

葡萄糖、苯酚、浓硫酸、纤维素酶、氢氧化钠（GB/T 629—1997）、盐酸（GB/T 622—2006），上海埃彼化学试剂有限公司提供。

1.1.3 仪器与设备

DHG-9240A 型BS 电热恒温鼓风干燥箱（60 目筛），上海康路仪器设备有限公司产品；80-2 型电动离心机、HH-6 型数显恒温水浴锅，上海梅香仪器有限公司产品；JM-B5102 型分析天平，余姚市纪铭称重校验设备有限公司产品；多功能粉碎机，铂欧五金厂产品；722 型分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理

选用新鲜、无虫害的杏鲍菇，用清水洗净，切片，60 ℃下烘干，用粉碎机将其研磨成粉末状，过60 目筛，放于瓶中，干燥保存。

1.2.2 杏鲍菇多糖的提取

将去核的杏鲍菇置于恒温干燥箱中，经烘干、粉碎，过60 目筛备用。准确称取1.00 g 杏鲍菇粉末于锥形瓶中，pH 值6.00 条件下，以料液比1∶30（g∶mL） 加入蒸馏水，超声提取20 min，离心过滤后取上清液。向滤液中加入0.8%的纤维素酶，在酶解温度60 ℃，酶解时间90 min 条件下进行酶解提取。将酶解液置于沸水浴中加热10 min 灭酶，冷却至室温，离心过滤，得到杏鲍菇多糖提取液，用苯酚- 硫酸法测定提取液中多糖含量。

1.2.3 杏鲍菇多糖含量的测定及计算方法

采用苯酚- 硫酸分光光度法测定多糖含量。精确称取105 ℃干燥至恒质量的葡萄糖100 mg 于500 mL容量瓶中，加蒸馏水定容。分别量取0，0.2，0.4，0.6， 0.8，1.0 mL 标准溶液于25 mL 试管中，加蒸馏水至2.0 mL并摇匀。分别加入新配制的苯酚试剂1.0 mL，浓硫酸5 mL，摇匀。置于沸水浴中加热20 min后于波长490 nm 处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线公式。

取杏鲍菇多糖提取液，按上述方法测吸光度，代入方程，求多糖含量，从而求多糖提取率。

1.2.4 单因素试验

（1） 料液比对杏鲍菇多糖提取率的影响。准确称取1.00 g 杏鲍菇粉末，在pH 值6.0 条件下，分别以料液比为1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40（g∶mL） 加入蒸馏水，超声时间20 min，离心后取上清液，加入0.8%的纤维素酶，在60 ℃条件下酶解90 min，经灭酶、冷却，测定多糖含量。

（2） pH 值对杏鲍菇多糖提取率的影响。准确称取1.00 g杏鲍菇粉末，在最佳料液比条件下，分别调节pH 值至5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，超声时间20 min，离心后取上清液，加入0.8%的纤维素酶，在60 ℃条件下酶解90 min，经灭酶、冷却，测定多糖含量。

（3） 超声提取时间对杏鲍菇多糖提取率的影响。准确称取1.00 g 杏鲍菇粉末，在最佳料液比及pH 值条件下，分别以超声时间10，15，20，25，30 min进行提取，离心后取上清液，加入0.8%的纤维素酶，于60 ℃条件下酶解90 min，经灭酶、冷却，测定多糖含量。

（4） 酶添加量对杏鲍菇多糖提取率的影响。将超声提取所得滤液中分别加入添加量为0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%的纤维素酶，在60 ℃条件下酶解90 min，经灭酶、冷却，测定多糖提取率。

（5） 酶解温度对杏鲍菇多糖提取率的影响。向超声提取后获得的滤液中加入最佳添加量的纤维素酶，分别采用酶解温度为50，55，60，65，70 ℃，酶解90 min。经灭酶、冷却，测定多糖含量。

（6） 酶解时间对杏鲍菇多糖提取率的影响。向超声提取后获得的滤液中加入最佳添加量的纤维素酶，在最佳酶解温度条件下，分别设置酶解时间为70，80，90，100，110 min 进行酶解提取。经灭酶、冷却，测定多糖提取率。

1.2.5 酶解过程的正交试验设计

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

根据单因素试验结果，选择酶添加量、酶解温度和酶解时间三因素进行正交试验，分别对3 个因素设计3 个水平，以多糖提取率为评价指标，设计L9（33）正交试验，优化杏鲍菇多糖提取工艺条件。

1.2.6 验证试验与传统水提法的比较

准确称取1.00 g 杏鲍菇，按照试验得出的最佳提取工艺条件提取杏鲍菇多糖，重复3 次取平均值，并与传统水提法提取杏鲍菇多糖比较提取效果。

2 结果与分析

2.1 料液比对杏鲍菇多糖提取率的影响

料液比对杏鲍菇多糖提取率的影响见图1。

图1 料液比对杏鲍菇多糖提取率的影响

由图1 可知，提取率随着料液比的增大而慢慢增大，当料液比为1∶30 时达到最高，随着溶剂的继续增加，多糖的提取率变化不大。溶剂量的增加，使得超声波介质的液体增加，细胞内外部浓度差距变大，多糖提取率的上升是根据多糖类物质向外扩大的速度。当料液比达到1∶30 时，其提取量达到了极限，提取率不再提高。为了不让随后的工艺负荷压力太大，提取剂的添加量不应过多，因此多糖提取效果最好的料液比为1∶30。

2.2 pH 值对杏鲍菇多糖提取率的影响

pH 值对杏鲍菇多糖提取率的影响见图2。

图2 pH 值对杏鲍菇多糖提取率的影响

由图2 可知，随着pH 值的增大，多糖提取率逐渐升高。当pH 值为6.0 时，多糖提取率最高；继续增大pH 值，溶液酸碱性影响了酶和底物的空间结构，使得两者的结合受到一定影响，同时加剧了杏鲍菇多糖的分解，导致多糖提取率的降低，因此多糖提取的最佳pH 值为6.0。

2.3 超声时间对杏鲍菇多糖提取率的影响

超声时间对杏鲍菇多糖提取率的影响见图3。

图3 超声时间对杏鲍菇多糖提取率的影响

由图3 可知，多糖提取率随着超声时间的延长不断提高，20 min 时达到最大。超声处理提高了颗粒内部的温度和压力，扩散速率加快；同时，由于超声处理使细胞壁受到破碎而孔径增大，利于细胞内多糖溶出；时间继续延长，提取率呈下降趋势，可能是由于超声时间过长，降低了某些反应的活化能，从而导致糖结构的变化和破坏，也可能是由于蛋白质变性沉积在颗粒表面，导致多糖提取率下降。因此，超声时间控制在20 min 为宜。

2.4 酶添加量对杏鲍菇多糖提取率的影响

酶添加量对杏鲍菇多糖提取率的影响见图4。

图4 酶添加量对杏鲍菇多糖提取率的影响

由图4 可知，杏鲍菇多糖提取率会根据纤维素酶添加量的提高而上升，主要是底物与酶接触面增大，使得酶对多糖提取效率大大提高。当纤维素酶添加量提高到0.8%时，纤维素酶与底物的接触面积达到饱和状态，接触面积不再扩大，杏鲍菇多糖提取率会随着酶添加量的增加不再上升，逐渐趋于于稳定。此时，杏鲍菇中多糖到提取率到达最高水平。因此，确定纤维素酶添加量为0.8%比较合理。

2.5 酶解温度对杏鲍菇多糖提取率的影响

酶解温度对杏鲍菇多糖提取率的影响见图5。

图5 酶解温度对杏鲍菇多糖提取率的影响

由图5 可知，杏鲍菇多糖提取率根据酶解温度的提高而上升，当温度升高到60 ℃时多糖提取率最高。继续提高酶解温度，则会使得多糖提取率逐渐下降，因为在酶促反应中，反应物能量提高是根据温度上升，加速酶的反应，若试验温度超过酶可接受最高温度范围，将会造成酶蛋白质变性或者失去活性，直接使得多糖提取率快速下降。因此，选择60 ℃为最适宜的酶解温度。

2.6 酶解时间对杏鲍菇多糖提取率的影响

酶解时间对杏鲍菇多糖提取率的影响见图6。

图6 酶解时间对杏鲍菇多糖提取率的影响

由图6 可知，杏鲍菇多糖提取率会随着酶解时间的不断增加而上升，当酶解时间为90 min 时，杏鲍菇多糖提取率上升且趋于稳定；当时间到100 min时，多糖提取率达到最高水平；而在90～100 min 时多糖提取率增加并不显著，主要是因为酶解持续时间过长，多糖在底物中含量过低，细胞内外的浓度差逐步减小，同时也加大了杂质在提取液中的溶解量，多糖提取率上升不明显。随着酶解时间的延长，多糖提取率变化不大。因此，选择90 min 为最佳酶解时间。

2.7 酶解过程的正交试验优化

正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果

由表2 极差分析，试验中3 个因素的影响力大小顺序为A＞C＞B，对应影响酶解杏鲍菇多糖提取率效果因素的强弱顺序为酶添加量＞酶解时间＞酶解温度，且杏鲍菇多糖的最佳酶解工艺为A2B3C3，即酶添加量0.8%，酶解温度65 ℃，酶解时间100 min。

2.8 验证试验与传统水提法的比较

由于计算出的最优组合不包含在正交表中，因而按最优组合配方进行试验验证，得出杏鲍菇多糖提取率为28.06%，因此确定A2B3C3为杏鲍菇多糖的最佳酶解工艺条件。

在不加纤维素酶及超声的条件下，按照传统水提法，即料液比1∶30，pH 值6.0，提取时间20 min，提取温度60 ℃进行杏鲍菇多糖的提取，可得杏鲍菇多糖提取率为18.32%。由此可知，超声辅助酶解法可以明显提高杏鲍菇多糖的提取率，原因可能是超声配合纤维素酶能够破坏植物细胞壁中的纤维素结构，促进多糖从杏鲍菇细胞中溶解出来。

3 结论

（1） 超声辅助酶解法提取杏鲍菇多糖的最佳提取条件为料液比1∶30，pH 值6.0，超声时间20 min，酶添加量0.8%，酶解时间100 min，酶解温度66 ℃。在此工艺条件下杏鲍菇多糖提取率最高，为28.06%。

（2） 纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，性质稳定，在传统水提法的条件下不易水解。试验采用超声辅助纤维素酶法提取杏鲍菇多糖，能有效提高杏鲍菇多糖提取率，其多糖提取率远高于传统水提法，同时提取温度较低，反应条件温和、快速、高效。