顶空固相微萃取和同时蒸馏萃取技术在肉制品风味分析中的应用

马嘉晨，黄 迪，徐文思，龚叶春，刘懿漩，杨祺福，贺 江，王伯华

（湖南文理学院生命与环境科学学院，水产高效健康生产湖南省协同创新中心，环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室，常德市农业生物大分子研究中心，常德市人工智能与生物医药研究中心，湖南常德 415000）

随着经济水平的提高，消费成本降低，我国肉制品消费不断升级，消费者对肉制品品质要求也不断攀升，肉制品的风味成为了评价其品质优劣的重要感官指标之一。肉制品的脂肪中不饱和烃基链氧化分解后会产生氢过氧化物，在有裂解酶或酸性条件下，氢过氧化物进一步反应生成醇、醛、酸、酯、酮、呋喃等挥发性风味物质，这些物质对肉制品产生特征香味具有重要作用[1]。目前，萃取肉制品中的风味成分主要有固相微萃取（Solid-phase microextraction，SPME）[2-3]、同时蒸馏萃取（Simultaneous distillation-extraction，SDE）[4]和超临界流体萃取（Supercritical fluid extraction，SFE）[5]等 方 法。其 中，SPME 是由加拿大学者Pawliszyn 及其合作者在1990 年提出[6]，在固相萃取技术基础上发展起来的新型萃取分离技术。而SDE 在1964 年就发展起来了，是一种能收集挥发性与半挥发性成分的有效方法，可以实现蒸馏与萃取同时进行[7]。

将HS-SPME、SDE 技术及两者在肉制品风味物质分析中的应用进行汇总分析，便于对肉制品风味研究有深入了解，为肉制品风味分析相关方面的研究提供一定参考。

1 顶空固相微萃取技术

1.1 HS-SPME 概述

SPME 作为一种新型高效的样品前处理技术，已经被广泛应用各种风味物质的检测中[6，8-10]。而顶空固相微萃取（Headspace solid phase microextraction，HSSPME） 属于其中一种，是一种简单方便、经济环保的绿色萃取技术。由于该技术可以同时实现采样、萃取、浓缩、进样的环节，所以很大程度上缩短了检测和分析时间[11]。且常与气相色谱- 质谱仪（Gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS） 联 合 使用，用于分析待测物中的有机挥发性物质。

HS-SPME 装置主要由萃取头和手柄构成（图1 所示），使用时主要由纤维萃取头上的涂层发挥作用[12]。原理是将待测样品放入一个密闭的容器中，纤维萃取头顶空置于样品上方，一段时间后，样品中的挥发成分便从其中释放出来进入容器的顶空，并且逐渐吸附于纤维萃取头上，待吸附平衡后萃取完成。随后将萃取头置于GC-MS 进样口进行热解析，随载气进入色谱柱进行分离分析[13]。

图1 SPME 萃取头

SPME 萃取头[14]见图1。

1.2 HS-SPME 萃取条件优化

影响HS-SPME 的主要因素有样品量、萃取温度、萃取时间、NaCl 添加量及平衡时间等[15]。且因影响因素较多，使试验结果误差较大，因此一般需要进行条件优化，以探索最优的HS-SPME 萃取条件。常用的HS-SPME 优化方法为单因素试验分析法。即分别分组进行试验，比较分析不同平衡时间、盐度、萃取时间和萃取温度的萃取效果，选取一组最优参数作为萃取条件。

1.2.1 平衡时间的选择

平衡时间在特定的范围内时，挥发性风味物质达到相对平衡状态，有利于萃取头吸附。由于挥发性物质在空气中扩散较快，萃取时很容易达到平衡状态，因此随着平衡时间的延长，萃取头逐渐趋于饱和，影响其萃取效果[16]。

1.2.2 食盐添加量的选择

食盐添加量对样品中的挥发性物质含量影响也较大。适量的盐离子可增加待测组分的离子强度，提高HS-SPME 分析法的灵敏度，但若NaCl 添加过量，一些挥发性组分的扩散速度可能会因此降低，可能与盐离子表面的阻碍吸附有关[17]。

1.2.3 萃取时间的选择

对挥发性风味成分的萃取也会受到萃取时长的影响，在一定萃取时间范围内，挥发性成分的峰面积先明显增大后减小，因为到达一定时间后，挥发性物质到达平衡状态，萃取头处于饱和[16]。若萃取时间过长，已经被吸附的组分可能出现吸附现象，从而降低萃取效果[18]。

1.2.4 萃取温度的选择

不同萃取温度对萃取效果影响较大，温度过低不能使样品中风味物质完全挥发出来吸附于萃取头上；而温度过高则会使已经吸附于萃取头上的挥发性物质解析，重新回到样品顶空中去。因此，要对萃取温度进行优化，选取最优的萃取温度作为萃取条件。

1.3 挥发性风味成分分析

挥发性风味分析的定量方法主要有面积归一法、内标法、外标法及标准加入法。归一法特点是其简单有效，可用来进行半定量以获取大量数据，是一种相对定量方法。内标法是目前国外应用较为广泛的，其优势在于可消除试验操作中的误差，且检测结果也更加准确可靠。而在选择不到合适的内标物时，可以使用标准加入法。标准加入法就是将待测物的纯物质当作标准物质加入待测样品中，用相同色谱条件分别测定标准物质加入前后的峰面积，然后计算该标准物质在样品中的含量[19]。外标法也称标准曲线法或直接比较法，是使用待测物的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测物质的响应信号相比较而进行定量的方法，是一种简便且快速的绝对定量方法[20]。

2 同时蒸馏萃取技术

2.1 SDE 概述

SDE 是集提取、分离和富集样品中挥发性、半挥发性成分于一体的方法[21]，随着人们对于食品安全的逐步关注，SDE 被人们所熟知。目前，其作为气相色谱法、气相色谱- 质谱联用等技术的前处理技术，已经在各类食品中的挥发性和半挥发性风味物质萃取与分析中得以广泛应用。

SDE 是将样品液相与萃取溶剂同时加热至沸腾状态，含有待测样品的水蒸气与萃取溶剂蒸气充分混合后，再经水冷凝，两相充分接触可以实现组分之间的相转移（装置如图2 所示），是将样品与水的混合液置于仪器右侧烧瓶中，仪器左侧烧瓶盛装萃取溶剂，两瓶同时加热至沸腾，待测样品蒸汽和萃取溶剂蒸汽同时在仪器顶部冷凝下来，样品中的挥发性与半挥发性的风味成分被萃取溶剂捕集，带有样品的水相和溶剂相在装置C 侧的U 形管中分层。随着萃取的进行，两相分别回流至两侧烧瓶中，如此蒸馏萃取过程循环进行，样品中的挥发性、半挥发性组分逐步经水相转移入萃取溶剂中，且只需要少量溶剂就可提取大量样品，风味成分就能够得以浓缩。萃取结束之后，收集装置A 侧烧瓶和C 侧U形管中的溶剂相，合并的溶剂相经脱水、浓缩后即可用于分析检测。

图2 SDE 萃取装置

SDE 萃取装置[22]见图2。

2.2 SDE 萃取条件优化

影响SDE 萃取效率因素众多，其中主要因素有萃取溶液的种类、水的添加量及蒸馏- 萃取时间等。试验过程中通常会利用单因素试验优化SDE 萃取参数，以得到最优的SDE 萃取条件。

2.2.1 萃取溶剂的选择

SDE 是根据相似相溶原理，当挥发性成分或半挥发性成分在溶剂中的溶解度大于其在样品中的溶解度时，样品中的挥发性成分或半挥发性成分被萃取富集到溶剂中，故萃取溶剂的选择要考虑溶剂的密度、极性、沸点等物理性质。常用的萃取溶剂有二氯甲烷、正戊烷、异戊烷、乙醚、氯仿、乙酸乙酯以及戊烷/二乙醚混合溶剂等。大部分相关研究多选择二氯甲烷作为萃取溶剂，而对于某些特定类别的化合物，其他溶剂可能表现出更高的效率，但使用最广泛的是二氯甲烷。赵健等人[23]利用SDE 法萃取黑猪肉中香气物质时选择二氯甲烷为萃取溶剂。

2.2.2 水添加量的选择

SDE 萃取过程中，用于水蒸气蒸馏的水添加量在一定程度上影响了萃取效果。在一定范围内，当水添加量逐渐增多时，水蒸气上升量增多，此时可携带更多的挥发性风味成分，增大了样品与萃取溶剂接触量，从而提高了萃取效率，使得测得的化合物总峰面积增多；而在此基础上，继续增加水添加量，使得样品端蒸气上升速度和冷凝速度加快，致使挥发性成分无法被溶剂充分萃取，从而化合物峰面积减少。师瑞等人[24]在萃取浓香葵花籽油香气活性物质时选择最佳的水添加量为200 mL。

2.2.3 萃取时间的选择

对最佳萃取时间进行经验性研究后发现，经过测试，最长达48 h 的SDE 可以从肥皂中提取出挥发性较低的化合物，如肉桂醇、2 - 苯乙醇等。当被萃取样品中含有脂类物质时可能会大大增加萃取所需时间，而对于某些非脂肪类物质（如植物和非脂肪食物） 来说，1～2 h 就足够了，但对于现在较复杂的样品来说，萃取时间一般为2～4 h[25]，若时间过短，可能会导致回收率偏低，而时间过长，则有可能使样品发生严重的热反应而引入干扰物质。王蒙等人[26]在采用SDE 法分析猪肉炖煮过程产生的风味物质时，选取的萃取时间为3 h。

2.3 SDE 和HS-SPME 的比较

随着精密分析仪器不断迭代更新，为食品中挥发性与半挥发性风味成分的分析研究提供了越来越完善的技术和方法[27]。但单一的萃取方法并不能很全面地提取出食品中的所有风味物质，所以需要根据不同的样品类型、研究目的和试验条件来选择合适的萃取方法，或者采用多种萃取方法，建议使用多种萃取技术。

SDE 将溶剂萃取与蒸汽蒸馏两者相结合，利用少量溶剂就能萃取出大量的风味物质，操作简便，定性定量分析效果很好[28]。而HS-SPME 则是将采样、样品净化和预浓缩整合为一个试验操作，无需溶剂就能简单快速地萃取吸附挥发性风味物质，近几年此项技术在食品烹饪过程中也有广泛应用[29]。陈红霞等人[30]采用HS-SPME 和SDE 这2 种方法提取“伊拉兔”腹部肌肉中的风味成分，并采用GC-MS进行分析鉴定，共检测出47 种风味物质，而对比2 种方法提取相同样品中的风味物质经GC-MS 检验结果明显可看出，采用SDE 法能萃取到的挥发性物质更多，更适合用来萃取高沸点低挥发性物质，如烃类、酯类等；而HS-SPME 法处理样品时间短暂、温度低且操作步骤简单，萃取到的挥发性物质几乎没有变化，更接近真实的挥发性风味，故更适合于检测易挥发性物质。通常会同时采用SDE 与HS-SPME 这2 种方法去对同一个样品中的风味成分进行萃取，将两者的分析结果结合考虑可更全面地评价样品中的风味物质。

3 HS-SPME 和SDE 技术在肉制品风味分析中的应用

3.1 鲜肉制品

生肉几乎不产生风味物质，因此肉中风味生成的反应非常复杂，其中包括肉中各成分中的热降解、脂质热氧化、氨基酸与碳水化合物之间的反应，以及各种复杂反应之间的相互作用[27，31-34]。

邹英子等人[35]通过HS-SPME 联合GC-MS 对黑香猪后腿肉进行分析检测，共检出61 种挥发性风味物质，包括醛类、醇类、酮类、酯类、碳氢化合物及杂环化合物等。结果表明，黑香猪肉挥发性物质以醛类为主体，其相对含量约为69.989%；其次，分别为醇类、酮类、杂环化合物、碳氢化合物、酯类和其他化合物。根据其研究可知，对黑香猪肉挥发性风味物质贡献较大的化合物主要有己醛、壬醛、（Z） - 2 - 庚烯醛、辛醛、庚醛、（E,E） - 2,4 - 癸二烯醛、1 - 辛烯- 3 - 醇和2 - 戊基呋喃。马瑜璐等人[36]以新鲜猪肉为研究对象，采用HS-SPME 与GC-MS 联用技术分别检测猪肉在不同新鲜程度下挥发性成分的变化，想要建立一种可用于评价猪肉的新鲜度的检测方法。结果表明，随着新鲜程度的变化，猪肉样中的挥发性成分会发生明显的变化。在测定鲜肉中的风味成分时，多在萃取时对样品进行加热来模拟鲜肉烹饪的过程。

3.2 加工肉制品

3.2.1 烟熏肉、腊肉制品

烟熏是利用熏材不完全燃烧而产生的烟气成分和热量来加工肉制品一种常见方法，而其中最具有代表性的肉制品是腊肉。熏烤制品中的香气成分来源有2 种[37]：一种是熏烟中的香气成分，烟熏烤时被肉品吸附；另一种则是在熏烤时，肉中糖类、蛋白质及脂肪间的相互反应及其降解产物。腊肉风味的形成是一个极为复杂的过程，目前仍不知道是哪种或哪类化合物使其具有其独特的风味[34]。

张宁等人[38]采用HS-SPME 法和SDE 法萃取“童家腊牛肉”样品中的挥发性风味成分，共萃取分析出78 种风味物质，其中包括2 种烷烃化合物、26 种醛类化合物、25 种醇类化合物、8 种酮类化合物、3 种脂肪酸类化合物、4 种醚类化合物、1 种酯类化合物和9 种含硫含氮及杂环化合物。HS-SPME 法和SDE法分别萃取到了29 种和69 种挥发性风味成分，其中这2 种方法同时得到的风味成分有20 种。由其研究结果可看出，HS-SPME 对易挥发、低阈值的化合物萃取效果好，但萃取到的化合物比例并不能反映样品顶空萃取时挥发性物质在顶空的比例，可能因为不同HS-SPME 萃取纤维不同的选择性。相反，SDE 对半挥发性与阈值高的化合物萃取效果更好，但是SDE 的萃取条件为高温长时间蒸煮，有可能使一些低沸点的物质挥发，形成一些非样品成分的其他物质。因此，同时使用HS-SPME 法和SDE 法能够更全面、客观地分析肉制品中的风味成分。

3.2.2 烘烤肉制品

肉在烘烤制作过程中由于发生美拉德反应而使肉的色泽与气味发生改变。诱人香味来源主要是羰基化合物与醛类物质，如丁二酮；金黄色与焦糖味的产生主要是发生了美拉德和焦糖化反应[39]。此外，加热后的脂肪发生了氧化反应，也使肉制品在烘烤后产生了独特的风味；氨基酸与糖类是烘烤肉制品形成诱人风味化合物的重要前体物质。

秦刚等人[40]用HS-SPME 法和SDE 法对“荣昌猪肉原料”样品A 和3 个不同加工中心温度点的样品B，C，D 的挥发性风味物质进行萃取，其中HSSPME 萃取出样品A 中的挥发性风味化合物126 种，样品B 中的挥发性风味化合物116 种，样品C 中的挥发性风味化合物131 种，样品D 中挥发性风味化合物148 种；而SDE 萃取出样品A，B，C，D 中的挥发性风味化合物分别为113 种、157 种、155 种、144 种。可见，不同萃取方式对风味化合物的提取效果存在一定差别，其中HS-SPME 法效率高，能够一定程度上反映出样品真实风味，SDE 法溶剂使用量小，萃取出的风味化合物较多，但长时间加热会导致其他成分产生，制造出风味假象。刘源等人[41]应用HS-SPME-GC-MS 分析检测了生鸭肉、烘烤鸭肉、水煮鸭脯肉、鸭腿肉样品中的挥发性风味物质，并且 与WU Chung-may，Lesimlple S 等 人[42-43]采 用 的SDE 法所测得的挥发性风味物质相比较。结果表明，SDE 法采用溶剂萃取，对高沸点化合物提取效果好，但耗时较长且容易发生热解；而HS-SPME 法中易挥发风味化合物较多，基本反映出了真实的鸭肉制品中挥发性风味成分。

3.2.3 酱卤肉制品

酱卤肉制品是将畜禽肉及其副产品，采用卤煮等工艺的加工所制[44]。其具有浓厚的香味、独特的风味和鲜亮的色泽，因此深受广大消费者的喜爱。

王东杰[45]以猪后腿肉为原料制作酱肉，采用HSSPME-GC-MS 技术对其风味物质成分进行提取与鉴定，经GC-MS 分析检测到8 类共65 种挥发性风味物质，主要风味化合物是醇、醛和烃类。对酱肉风味的形成起主要作用的是醇类和醛类化合物；对酱肉风味的呈现起协调平衡作用的是酯类化合物，如丁酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯和2 - 乙酰基呋喃等。此外，还比较了SDE 法和HS-SPME 法对酱肉中挥发性物质的提取效果，SDE 法检测出风味物质61 种，HS-SPME 法检测出风味物质65 种，降低酱肉腌制过程中的温度，会产生一些低沸点的挥发性风味物质，采用HS-SPME 法比用SDE 法能更加客观、真实地反映出酱肉中的风味挥发性物质。

3.2.4 油炸肉制品

油炸肉制品是肉制品在高温油脂下进行热加工的过程。油炸后的肉制品，表面发生脱水硬化并伴随焦糖反应；蛋白质和脂质的降解伴随着美拉德反应的发生进而产生芳香物质；脂质降解后便有大量挥发性化合物散发，从而使油脂肉制品产生出独特的香气与风味[39]。

孟祥忍等人[46]采用了HS-SPME-GC-MS 技术比较分析了传统油炸、微波加热和空气炸锅加工后对黄金猪排挥发性风味成分的影响。这3 种油炸方式都使黄金猪排生产了醛类化合物，其中在空气炸锅油炸的黄金猪排中检测出了有烘烤香气的2,3 - 二甲基吡嗪。根据文献[46-48]中对不同工艺的油炸食物进行风味物质的萃取与分析比较，不仅可用来改善油炸肉制品的风味与口感，而且可用来控制肉制品中的不良风味与有害物质。

3.3 液体肉汤制品

目前，已报道的关于肉汤中风味成分分析方法有SDE-GC 或SDE-GC-MS 法[49]。袁华根等人[50]采用SDE 和HS-SPME 分别萃取了鸡肉汤中的挥发性风味物质，再通过GC-MS 进行分析，共检测出挥发性物质87 种。其中，HS-SPME 法检测出55 种化合物，SDE 法鉴定出41 种化合物。对于液体肉汤制品中的挥发性风味物质来讲，SDE 与HS-SPME 各有优缺点，可互补使用。但是低沸点、低阈值、易挥发、小分子量的化合物，对风味的贡献更大，HS-SPME方便、快速、重复性好、灵敏度高，所以在萃取鸡肉汤挥发性风味物质时HS-SPME 更胜一筹。

秦艳秀等人[51]在Lingxia Sun 等人[52]的基础之上，采用了HS-SPME 法研究香叶在循环煮制过程中对猪里脊肉汤挥发性风味的影响，发现肉汤中共有45 种挥发性化合物，而且在香叶煮制1 次时，猪里脊肉汤中挥发性风味成分的种类和含量最多，其总量随着煮制次数的增加而减少。随着煮制次数的增加，来自于香叶中的醇、醚、酚和酯类化合物的含量明显减少，而且是在煮制2 次后含量骤减，来自于猪肉中的醛、酮类化合物的含量没有明显变化。

4 结语

综述了HS-SPME 技术、SDE 技术及两者在肉制品风味分析中的应用。HS-SPME 和SDE 作为主要的风味分析方法，在肉制品风味分析方面应用已十分广泛。由于HS-SPME 和SDE 技术各具优缺点，SDE法萃取时间较长，但能萃取到更多的挥发性化合物，适合对高沸点、低挥发性物质的分离；HS-SP-ME 法出峰少，但快速简便、更接近真实挥发风味，适合检测易挥发性的化合物。因此，建议对同一个样品分别采用HS-SPME 法和SDE 法萃取其中的风味成分，更能客观、全面、综合地做出评价。

肉制品风味组成复杂，成分也较多，HS-SPME和SDE 技术联合使用分析还需加强。随着经济的发展，人们对食品品质要求越来越高，HS-SPME 与SDE 技术联用以综合评价肉制品中的风味，为肉制品风味形成机理和产生途径等方面的研究提供更多的依据。相信随着研究的不断深入，2 种技术将在肉制品新鲜度评价、品质预测及肉制品的不良风味等方面具有广阔的应用前景。