防治猕猴桃溃疡病涂抹剂的研制及其应用

陈 佳, 王 垚, 陈学堂, 王炳策,李文志, 王为镇, 龙友华*,,3

(1.贵州大学 作物保护研究所，贵阳 550025；2.贵州大学 猕猴桃工程技术研究中心，贵阳 550025；3.贵州大学 教学实验场，贵阳 550025)

猕猴桃溃疡病是猕猴桃产业中极具毁灭性的病害，该病可从猕猴桃幼芽及伤口等多处侵染发病，但主要为害枝干，属于典型的枝干类病害[1-2]，其病原为丁香假单胞菌猕猴桃致病种Pseudomonas syringaepv.actinidiae(Psa)，该病菌具有隐蔽性强、繁殖快、传播迅速等特点[3]。目前，对猕猴桃溃疡病的防治已成为世界性难题，因其爆发造成严重损失甚至毁园的情况在全球猕猴桃产区多次发生，给猕猴桃产业发展带来了巨大阻碍[4-7]。

目前，施用水基型制剂仍是防治猕猴桃溃疡病的主要方法[8-11]，由此带来两方面问题：一是通常采用喷雾法施药，导致附着率不高，农药利用率低，易造成药剂浪费与环境污染[12]；二是水基型制剂施用后不易成膜，仅能降低果园中的病菌密度，一定程度减少小型伤口的侵染率，而大型伤口仍为其主要侵染途径[13]。因此，探究一种具有高附着率、高利用率、可封闭治疗猕猴桃溃疡病的新型防控技术显得尤为重要。

现有的涂抹类剂型包括膏剂、糊剂和涂抹剂，通过枝干涂抹附着进行伤口治愈，是枝干类病害防治的一个新发展方向[14]。涂抹剂 通过将药剂均匀溶解或分散在含成膜材料的溶剂中，采用涂抹的方式使之附着于病患处形成薄膜，以封闭治疗病虫害，可有效提高药剂利用率[15]。该技术基于植物防御保护理念，从物理防御角度阻隔外源病菌侵染，减少有害生物为害，从而实现对目标作物的保护，膜结构的形成则是其发挥高防效的关键所在[16]。陶希芹等[17]以二氧化钛 (TiO2)和壳聚糖 (CTS) 为成膜物质，研制了一种新型涂膜剂，加入农药 (P) (霉灵，hymexazol) 后制备得到了CTS-TiO2-P 复合膜，与单独施用该农药相比，所制备的复合膜可显著提高农药的持效期；陈大为[18]研制了一种生防菌涂抹剂，成膜性好、附着性强，贮存120 d 后仍可高效防治苹果腐烂病；陈悦[19]探究了50%木焦油MTC 涂抹剂对猕猴桃溃疡病的防治效果，发现其防效达90% 以上，且该涂抹剂成膜效果好、抗雨水冲刷能力强，可促进植物愈伤组织生长，为猕猴桃溃疡病的防治提供了新思路。在进行涂抹剂研制时，对成膜材料的筛选是其基础，之后再根据防治对象的不同，有针对性地向其中添加杀虫剂或杀菌剂等活性成分，若加入的活性成分为复配药剂，还有望在提高防效的同时延缓抗药性的产生[20-21]。基于此，本研究根据溃疡病侵染及为害特点，通过组分筛选，采用成膜工艺制备了一种可稳定附着于猕猴桃树干上的基础涂抹剂，并通过向基础涂抹剂中加入复配杀菌剂后制成含药涂抹剂，以期为猕猴桃溃疡病的高效防控探寻新途径。

1 材料与方法

1.1 材料及试验地概况

1.1.1 供试菌株 丁香假单胞菌猕猴桃致病变种Pseudomonas syringaepv.actinidiae(Psa)，由贵州大学猕猴桃工程技术研究中心保藏并提供。

1.1.2 其余材料 培养基为营养琼脂 (NA) 和营养肉汤 (NB) (上海博微生物科技有限公司)。杀菌剂：1.5%四霉素 (tetramycin) 母药 (辽宁微科生物工程股份有限公司)；98%噻霉酮 (benziothiazolinone)原药 (浙江宇龙生物科技股份有限公司)；95%戊唑醇 (tebuconazole) 原药 (北京巨胜科技有限公司)。供试填料为农药剂型加工中常用填料[22-23]：重钙 (化学级，筛孔径45 μm，山东优索化工科技有限公司)；陶土 (化学级，筛孔径74 μm，景德镇玉泥陶瓷有限公司)；滑石粉 (化学级，筛孔径45 μm，青岛优索化工有限公司)；硅藻土 (食品级，筛孔径74 μm) 和纳米膨润土 (化学级，筛孔径45 μm) (河南信阳鑫鼎矿业有限公司)。供试增稠剂为农药剂型加工中常用增稠剂[24-25]：聚乙烯醇常规型 (化学级，聚合度 1100，醇解度99.0%～99.4%) 和聚乙烯醇2488 (化学级，聚合度2400，醇解度87.0%～89.0%) (上海麦克林生化科技有限公司)；羧甲基纤维素 (食品级，聚合度900，南京熙美诺生物科技有限公司)；羟丙基纤维素 (化学级，聚合度1000，石家庄天宏纤维素责任有限公司)；淀粉醚 (化学级，聚合度500，上海臣启化工科技有限公司)。渗透剂：津北 (主要成分氮酮含量为97%，漯河高值农业科技有限公司)；久农丰 (主要成分有机硅含量为96%，河北石家庄正安农业科技有限公司)；奇功 (主要成分聚氯乙烯醚改性三硅氧烷含量≥95%，桂林集琦生化有限公司)；一点透 (主要成分乙氧基改性聚三硅氧烷含量为95%，济南中科绿色生物工程有限公司)；透翠 (主要成分聚硅氧烷类化合物含量为96%，深圳诺普信农化股份有限公司)。

1.1.3 主要仪器 AL104 电子分析天平 (0.0001 g，梅特勒-托利多仪器有限公司)；GXZ 型培养箱 (宁波江南仪器厂)；雷磁PHS 系列pH 计 (上海仪电科学仪器股份有限公司)；JL-1C 菌落计数器 (杭州齐威仪器有限公司) 等。

1.1.4 试验地概况 贵州省息烽县猕猴桃种植基地(26°5′15.7″N，106°31′13.9″E)，黄棕壤土，种植猕猴桃品种为 ‘贵长’，4 龄树，架型为T 形，猕猴桃溃疡病近3 年连续发生。当地为亚热带季风性气候，平均海拔1256.0 m，年平均气温12.5 ℃，年平均降雨量1203 mm。

1.2 试验方法

1.2.1 涂抹剂配方筛选与优化

1.2.1.1 填料的筛选与优化 参照丁思雯等[26]的方法并稍作修改。通过沉降时间评估填料的分散性，沉降时间越长则表明分散性越高，反之亦然[27]。分别称取4.00 g 硅藻土、重钙、陶土、滑石粉和纳米膨润土，加水搅拌均匀，均配制成质量分数为4.00%的悬浮液，记录静置沉降至明显分层所需时间，筛选出其中分散性最佳的填料作为最适填料。取最适填料分别配制成质量分数为1.00%、2.00%、3.00%、4.00%、5.00%和6.00%的悬浮液，测定沉降时间并优化确定其分散性最佳的质量分数范围。

1.2.1.2 增稠剂的筛选与优化 参照宋星陈等[28]的方法进行。分别称取5.00 g 聚乙烯醇常规型、聚乙烯醇2488、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素和淀粉醚，加水搅拌至充分溶解，配制成质量分数为5.00%的溶液，静置至表面气泡消失后测定黏度、延展性、拉丝度及溶解条件等指标，综合进行评分，评分越高则表明成膜性能越优，筛选出其中成膜性能最优的增稠剂作为最适增稠剂。取最适增稠剂分别配制成质量分数为0.5 0%、1.00%、2.00%、4.00%、6.00%、8.00%、10.00%和12.00%的溶液，进一步优化确定其成膜性能最优的质量分数范围。

黏度：以清水作为对照，用磁力搅拌器在相同档位下搅拌各助剂溶液，根据转子转速快慢标注“+”、“+ +”、“+ + +”或“+ + + +”，加号越多表示转速越慢，即黏度越高，转速与水相当时标注“+”，根本未转动则标注“+ + + +”。延展性：以清水作对照，采用坐标纸法测定延展性，当助剂溶液延展面积为清水面积的 1～2 倍、>2～3 倍、3 倍以上时分别标注“+”、“+ +”和“+ + +”。拉丝度：观察制剂垂直拉起时的长度，0～1 cm 标注“0”，>1～2 cm 标注为“+”，>2～4 cm 标注为“++”，4 cm 以上标注为“+ + +”。溶解条件：溶解时需要助剂、加热等辅助条件标注为“0”，无需辅助条件标注为“+”。综合评分：统计各指标“+”的总数量，“+”越多则综合评分越高，表示成膜性能越优。

1.2.1.3 成膜助剂的确定 将优选出的适宜质量分数的填料与适宜质量分数的增稠剂按不同比例进行组合，以优化增稠剂的成膜性能，静置至表面气泡消失后测定相关指标并进行综合评分，确定成膜性能最优的组合作为成膜助剂。

1.2.1.4 渗透剂的筛选与优化 采用圆片帆布法[29]，根据帆布片沉入杯底所需时间比较渗透剂的渗透能力，所需时间越短则表示渗透能力越强，反之亦然。通过称重换算后，用移液枪分别量取2.00 g津北、久农丰、奇功、一点透和透翠，加入100 mL烧杯中配制成质量分数为2.00%的水溶液，将直径2.0 cm 的帆布片平放于杯口，从帆布片接触到液面时开始计时，记录帆布片沉底所需时间，筛选出渗透能力最强的渗透剂作为最适渗透剂。取最适渗透剂分别配制成质量分数为0.4 0%、0.80%、1.20%、1.60%、2.00%和4.00%的水溶液，比较帆布片沉底所需时间进一步确定其最适添加量。

1.2.2 基础涂抹剂的制备及理化性质评价 根据1.2.1 节中所筛选出的优化配方比例，往水中先加入填料与增稠剂制得成膜助剂，再加入渗透剂充分搅拌混匀制备得到基础涂抹剂，记作涂抹剂基#。以清水作对照，进行理化性质评价。参照陈大为[18]的方法评价制剂的外观形态及在树体上的附着性；参照胡贤锋[24]的方法评价所形成膜的状态；参照陈嘉琪等[30]所用的压滤纸法测定成膜时间：将5 g 涂抹剂涂抹至玻璃板上，每隔10 min测定一次固化情况，以滤纸纤维不粘在涂膜上的时间为成膜时间；参照宋星陈等[28]的方法测定黏度、延展性、拉丝度与固含量流失率，通过固含量流失率表征制剂的耐雨水冲刷能力；采用pH 计测定pH 值。

1.2.3 涂抹剂的室内抑制活性及田间防效测定

1.2.3.1 菌悬液制备 在无菌操作台内，用灭菌牙签蘸取Psa 菌种在已凝固的NA 平板上划线，25 ℃恒温培养48 h 后，挑取单菌落加入无菌NB 培养基中，以200 r/min 转速于25 ℃恒温振荡培养24 h，制得菌悬液，采用菌落计数器计数，添加无菌水调整其浓度为1 × 108CFU/mL，备用。

1.2.3.2 室内抑菌活性测定 向涂抹剂基#中分别添加本研究团队前期筛选得到的对猕猴桃溃疡病具有较高防效的复配杀菌剂组合1#(四霉素与戊唑醇质量比2∶1，以下简称四霉素 • 戊唑醇) 和组合2#(四霉素与噻霉酮质量比5∶1，以下简称四霉素 • 噻霉酮)[31]，分别制得涂抹剂1#和涂抹剂2#。采用滤纸片法测定涂抹剂基#、涂抹剂 1#、涂抹剂 2#及对应杀菌剂组合单独使用对病原菌Psa的室内抑制活性。将杀菌剂根据有效成分质量比两两复配后，以3 为公比，配制总质量浓度梯度分别为972、324、108、36 和12 mg/L 的各杀菌剂组合及相应涂抹剂 (各药剂质量浓度详见表1)，并配制不含抑菌活性成分的涂抹剂基#，分别向各处理中加入3 片已灭菌的滤纸片 (直径6 mm)，浸泡1 h。往100 mL 温度为 (45 ± 5) ℃的NA 培养基中加入1 mL Psa 菌悬液，混匀后按10 mL/皿制成平板，待平板凝固后在其中央接入药液浸泡过的滤纸片。以无菌水处理作为对照，每处理3 次重复，置于25 ℃恒温培养箱中培养48 h 后，测量抑菌圈直径并按(1)式计算抑制率(I，%)。以药剂有效成分总质量浓度的对数值为x 轴，抑制率机率值为y 轴，求出毒力回归方程。

表1 本研究中所用药剂的质量浓度Table 1 The mass concentration of the fungicide used in this study

式中：DPT为处理组抑菌圈直径，mm；DCK为对照组抑菌圈直径，mm。

1.2.3.3 田间防效试验 于2021 年11 月14 日，采用树干涂抹法开展田间防治试验。以清水作为对照，分别测定涂抹剂基#、涂抹剂 1#、涂抹剂2#及相应杀菌剂组合1#、2#单独使用的田间防治效果。采用随机区组设计，共6 个处理，每处理3 个小区，每个小区10 株猕猴桃。涂抹剂基#直接施用，其他处理按有效成分总质量浓度6 mg/L 进行施用 (组合中各药剂质量浓度详见表1)。涂抹3 个月后调查并统计各处理组猕猴桃溃疡病发生情况，参照猕猴桃溃疡病分级标准 (表2)，按公式(2)到(5)分别计算发病率(IR)、防效(C)、病情指数(DI)和相对防效(Cr)[31]。

表2 猕猴桃溃疡病分级标准[31]Table 2 Classification standard of kiwifruit canker[31]

式中：N0为总发病株数；N为调查总株数；IRC为对照组发病率；IRT为处理组发病率；Ni为各级病株树；Gi为该级代表值；DIC为对照组病情指数；DIT为处理组病情指数。

1.2.4 数据分析 采用Excel 2010、DPS 和Origin 等软件进行数据统计分析和可视化处理，多重比较采用Duncan’s 新复极差法。本研究中所有试验均设3 次重复，图表中数值表示3 次重复的平均值 ± 标准误，同列数据后小写字母表示差异显著性 (P＜ 0.05)。

2 结果与分析

2.1 涂抹剂配方筛选与优化

2.1.1 填料 比较不同填料的沉降时间 (图1A)，发现沉降时间最长的是纳米膨润土，为203.0 s，表明供试填料中分散性最优的是纳米膨润土，故筛选其作为最适填料。

图1 填料沉降时间Fig.1 Settling time of fillers

比较不同质量分数纳米膨润土的沉降时间(图1B)，发现沉降时间随其质量分数的增加而减少，但当其质量分数为1.00%～4.00%时，沉降时间均大于200.0 s，且无显著性差异，而当其质量分数为4.00%以上时，沉降时间随质量分数增加显著减少。表明纳米膨润土在质量分数为1.00%～4.00%之间时分散性最佳；当其质量分数高于4.00%时，体系分散性显著降低。因此，优化得出纳米膨润土的适宜质量分数范围为1.00%～4.00%。待进一步试验以确定其具体最适质量分数。

2.1.2 增稠剂 比较不同增稠剂的综合评分 (表3)，发现聚乙烯醇2488 的综合评分最高，为6 个“+”，其余依次为聚乙烯醇常规型、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素和淀粉醚，表明供试增稠剂中聚乙烯醇2488 的成膜性能最优，故筛选其作为最适增稠剂。聚乙烯醇主要结构为1,3-丙二醇，该结构兼具增塑性、表面活性和乳化性，这可能是其具有良好成膜性能的主要原因，而聚乙烯醇2488 的黏度高于聚乙烯醇常规型则是由于不同种类聚乙烯醇聚合度、醇解度方面的差异所致[32]。

表3 不同增稠剂的综合评分Table 3 Comprehensive scores of different thickeners

比较不同质量分数聚乙烯醇2488 的综合评分(表4)，发现随其质量分数增加，综合评分呈先升高后降低的趋势，且在质量分数为6.00%～10.00%时具有最高综合评分7 个“+”，表明聚乙烯醇2488在此质量分数范围内时成膜性能最优，因此优化得出聚乙烯醇2488 的适宜质量分数范围为6.00%～10.00%。待进一步试验以确定其具体最适质量分数。

表4 不同质量分数聚乙烯醇 2488 的综合评分Table 4 Comprehensive scores of PVA 2488 with different mass fractions

2.1.3 成膜助剂 将质量分数为1.00%～4.00%的填料纳米膨润土与6.00%～10.00%的增稠剂聚乙烯醇 2488 按不同比例进行组合，以优化聚乙烯醇2488 的成膜性能，结果发现，两者在不同的比例组合下，综合评分表现出差异性 (表5)。当质量分数为3.00%的纳米膨润土与10.00%的聚乙烯醇2488 组合时，综合评分最高，为10 个“+”，表明两者在该比例下成膜性能最优，故确定成膜助剂最优组合为3.00%纳米膨润土 + 10.00%聚乙烯醇2488。相关研究表明，聚乙烯醇具有良好的成膜、抗拉、涂布性能以及较高的生物相容性，可与膨润土、多孔钛等物质混合形成涂层[33-34]，本研究结果与之相似。

表5 不同比例纳米膨润土与聚乙烯醇 2488 组合的综合评分Table 5 Comprehensive scores of different proportions of nano bentonite combined with PVA 2488

结合表3 与表4，对比单一物质与组合物质的成膜性能，发现将不同比例填料与增稠剂组合后表现出了较单一物质更优的成膜性能，推测可能是因为两者组合后发生了某些性质上的改变[35]。

2.1.4 渗透剂 不同渗透剂组帆布片沉底所需时间存在显著性差异 (图2A)。其中耗时最长的是津北，为336.3 s；其余依次是久农丰、一点透和透翠；所需时间最短的是奇功，为10.8 s。表明供试渗透剂中奇功的渗透能力最强，故筛选其作为最适渗透剂。奇功的强渗透力可能是源于其主要成分聚醚改性有机硅表面活性剂优良的润湿性和渗透性，在进行制剂加工时，可以通过添加该渗透剂来提高活性成分的渗透性[36-37]。

图2 不同渗透剂组帆布片沉底所需时间Fig.2 Time required for the canvas to sink to the bottom in different penetrant groups

进一步比较发现，随奇功质量分数增加，帆布片沉底所需时间减少 (图2B)。其中，当奇功质量分数为1.60%～4.00%时，帆布片沉底所需时间最短，均小于11.5 s，表明添加质量分数为1.60%～4.00%的奇功时渗透能力最强，且在该质量分数范围内无显著性差异，故确定其最适添加量为1.60%。

2.2 基础涂抹剂的制备及理化性质评价

根据筛选出的配方，往水中先加入质量分数(下同) 为3.00%的纳米膨润土与10.00%的聚乙烯醇2488，制得成膜助剂，再加入1.60%的奇功充分搅拌混匀，制备得到基础涂抹剂，记作涂抹剂基#。其理化性质评价结果 (图3 与表6) 表明，涂抹剂基#为乳白色黏稠液体，呈弱酸性、高黏度、高延展性、高拉丝度、强树体附着性，在玻璃板上涂抹123 min 后可形成有韧性薄膜，膜的固含量流失率为 6.77%，耐雨水冲刷能力强。基于该涂抹剂良好的树体附着性、延展性及耐雨水冲刷性能等特点，相较于传统喷雾防治法，可克服传统水基型制剂黏度低、延展性差、不易附着、流失率高等缺点，从而提升防治效果。同时，该涂抹剂固化成膜所需时间短，涂抹后2 h 内无降雨即可成膜，受气候因素影响小，适于田间施用。

图3 涂抹剂基# 的理化性质Fig.3 Physicochemical properties of the paint base#

表6 涂抹剂基# 的理化性能指标Table 6 Physicochemical performance index of the paint base#

2.3 涂抹剂的室内抑菌活性及田间防效

2.3.1 室内抑菌活性 室内测定结果 (表7) 表明：涂抹剂基#对Psa 无抑制作用，涂抹剂1#、涂抹剂2#及杀菌剂组合1#、杀菌剂组合2#则均表现出了不同程度的抑制作用。其中涂抹剂2#的活性最高，EC50值为0.72 mg/L，其余依次为涂抹剂1#、杀菌剂组合2#和杀菌剂组合1#。将涂抹剂1#与杀菌剂组合1#、涂抹剂2#与杀菌剂组合2#两两比较，发现涂抹剂较对应杀菌剂组合的EC50值均明显降低，表明所配制的涂抹剂能明显提升杀菌剂的活性。其原因可能是因为将杀菌剂配制成涂抹剂后，通过化合物间的结合产生了新活性物质、优化了活性成分释放方式或提升了活性成分渗透性等方式，从而实现了杀菌剂活性的提高[38-40]。

表7 涂抹剂及对应杀菌剂组合对猕猴桃溃疡病菌的室内抑制活性Table 7 In vitro toxicities of paints and corresponding antibacterial combinations against P. syringae pv.actinidiae

2.3.2 田间防治效果 田间试验结果 (表8) 表明，各处理的发病率与病情指数均显著低于CK，表明各处理对猕猴桃溃疡病都有明显的防治效果。其中涂抹剂1#、涂抹剂2#的防效最高，均达65%以上；其余依次为杀菌剂组合2#和杀菌剂组合1#，防效在45%～60%之间；涂抹剂基#的防效最低。将涂抹剂1#与杀菌剂组合1#、涂抹剂2#与杀菌剂组合2#两两比较，发现涂抹剂的防效均显著高于对应杀菌剂组合，表明所配制的涂抹剂能显著提高杀菌剂的田间防效。结合表7 和表8 可知，田间防治效果与室内抑菌活性测定结果相对应，两部分试验可相互验证，证明涂抹剂能提升杀菌剂对猕猴桃溃疡病菌的抑制作用。

表8 涂抹剂及对应杀菌剂组合对猕猴桃溃疡病的田间防治效果Table 8 Field control efficacies of paints and corresponding antibacterial combinations on kiwifruit canker

3 结论与讨论

近年来，溃疡病严重影响了全球猕猴桃产业的健康发展[4-7]，由于其病原具有隐蔽性强、传播迅速等特点，导致该病的防治难度高，传统防治方法效果不理想[3]，抗性育种、矿物质调控、生防菌等多种新技术均已被探索用于猕猴桃溃疡病的防治中[41-43]，而在诸多新技术手段中，最适合用于苹果腐烂病、猕猴桃溃疡病这类枝干病害防治的农药剂型为涂抹剂[14]。本研究筛选确定了成膜性能最优的10.00% (质量分数，其余同) 聚乙烯醇2488 作为增稠剂，将其与分散性最佳的填料3.00%纳米膨润土组合制得成膜助剂，再加入渗透能力最强的渗透剂1.60%奇功制备得到基础涂抹剂 (涂抹剂基#)。理化性能评价表明，该涂抹剂基#树体附着性强、延展性强、成膜性能优、耐雨水冲刷能力强，综合性能良好，可稳定附着于猕猴桃枝干上，是一款适合田间施用的涂抹剂。室内抑菌活性测定表明，该基础涂抹剂本身对病原菌无抑制活性，但加入杀菌剂制成含药涂抹剂后，其抑制活性显著高于对应的杀菌剂，这与王明力[44]研制的抗菌壳聚糖复合膜作用相似。田间施用后，不含抑菌活性成分的基础涂抹剂防效可达30%以上，这可能与涂层的物理防御作用有关[45]；含药涂抹剂的田间防效可达65%以上，显著高于对应杀菌剂组合，表明涂抹剂能明显提高杀菌剂的防效，这与王康宁[46]以聚乙烯醇、聚乙二醇、膨润土等助剂及相应杀菌剂为原料研制的活性缓释涂抹剂效果相似，表明往涂抹剂中加入杀菌剂后能高效防控植物病害。

本研究制备了一种可稳定附着于猕猴桃树干的涂抹剂，往其中添加杀菌剂后能高效防治猕猴桃溃疡病，对田间病虫害的防治具有借鉴意义，但该基础涂抹剂防治猕猴桃溃疡病的增效机理尚不明确，有待于进一步研究。