多原核受精对IVF周期中获卵数低的患者助孕结局的影响

宏苹苹,李涛,欧建平,夏欣一

(1.南方医科大学 第一临床医学院,广东 广州 510515;2.中国人民解放军东部战区总医院 解放军临床检验医学研究所,江苏 南京 210002;3.中山大学 附属第三医院 生殖医学中心,广东 广州 510630)

在辅助生殖过程中,正常受精是通过观察到第1天在卵母细胞的细胞质中存在2个可见的原核来确定的,如果有3个及以上的原核则是多原核受精。多原核受精的受精卵是多倍体,是基因异常的受精卵,在常规的体外受精(invitrofertilization,IVF)周期中发生率为1%～4%,体外受精时通常会被丢弃,如果多倍体受精卵继续发育,则与植入后的自然流产、葡萄胎、多倍体畸形儿等有关［1］。多原核受精卵出现的机制［2-4］包括多精受精、正常精子进入异常卵子、异常精子进入正常卵子、卵子第二极体滞留未排出、原核碎裂等。

在常规的IVF周期中,对于拥有卵子数量较高的患者来说,多原核受精可能不会影响其最终的临床结果。然而,对于拥有卵子数量较低的患者来说,由于胚胎产量较低,辅助受精效果通常较差,如果发生多原核受精,就会进一步降低患者接受胚胎移植的成功率。在人类辅助生殖技术中,多原核受精对临床结局的影响仍存在争议,本研究旨在探讨在IVF周期中多原核发生与否对获卵数低的患者周期结局的影响,以优化这些患者胚胎移植后的活产机会,缩短受孕时间,为临床促排卵和实验室授精提供有价值的参考。

1 资料与方法

1.1 研究资料

1.1.1 研究对象

对2015年9月至2020年1月期间在中山大学附属第三医院生殖医学中心接受辅助生殖治疗的患者进行回顾性分析,共纳入1 306个 IVF周期。本研究获得中山大学附属第三医院伦理委员会审批(审批号:中大附三医伦［2021］02-275-01)。

纳入标准:①助孕方式为IVF;②获卵数为1～5枚卵子;③女方年龄为18～45岁;④有≥1个可利用胚胎。排除标准:①受精方式为卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI);②未进行胚胎移植的周期;③使用手术精子或冷冻解冻的睾丸精子;④移植后随访周期失联。

1.1.2 试剂与仪器

G-IVF PLUS培养液(货号:10136)、G-2 PLUS 培养液(货号:10132)购自瑞典Vitrolife公司;玻璃化冷冻液、玻璃化解冻液(货号:VT101、VT102)购自日本Kitazato公司;三气培养箱(型号:K-MINC-1000)购自澳大利亚COOK公司。

1.2 研究方法

1.2.1 卵巢刺激方案

根据女方的情况,采用不同的方案来刺激卵巢,主要有黄体期长方案、拮抗剂方案或其他方案(微刺激、自然周期等)。根据女性的基线特征选择合适的起始剂量,包括年龄、体质量指数(body mass index,BMI)、抗缪勒管激素水平(anti-müllerian hormone,AMH)和窦卵泡计数(antral follicle count,AFC)等因素,确定最佳的治疗方案。使用阴道超声和激素检查(雌二醇、黄体生成素和孕酮)进行周期监测,一旦观察到双侧卵巢中至少有一个直径达到18 mm的卵泡,便使用尿液纯化的人绒毛膜促性腺激素或重组人绒毛膜性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)来促进卵母细胞的最终成熟,36 h后,通过阴道超声引导抽取卵母细胞。

1.2.2 精液处理、胚胎培养及评估

精液完全液化后,使用密度梯度离心法制备精子,将精子在0.5～1 mL的培养液中重悬以供进一步使用。对拾获的卵母细胞进行彻底冲洗后,放入 G-IVF PLUS培养液中于37 ℃、6%CO2、5%O2和89%N2环境的三气培养箱中进行培养。应用HCG后40 h授精,授精浓度为(0.3×106)个/mL。

授精后16～18 h观察受精,如果出现两个原核,则视为正常受精;如果出现多于3个原核,则视为多原核受精,应立即丢弃胚胎。第3天根据卵裂球的数量、卵裂球大小均一程度和碎片程度来评估胚胎质量。第5、6天采用 Gardner 评分法［5］评估囊胚质量。

1.2.3 胚胎移植

第3天的卵裂胚移植的标准是至少有4个细胞,碎片率<30%,没有多核的迹象。囊胚移植的标准是有至少为3期及以上的囊胚。内细胞团质量评分为A级、B级或C级,滋养层评分为A级、B级或C级,但内细胞团及滋养层同时评分为C级则丢弃。最多可移植3个卵裂胚或2个囊胚。

1.2.4 胚胎冷冻和解冻

新鲜周期未进行移植的胚胎和/或移植后剩余胚胎均冷冻保存。胚胎冷冻使用开放式玻璃化冷冻法;胚胎解冻使用玻璃化解冻法,冷冻、解冻均使用商品化的试剂盒。胚胎解冻后置于G-2 PLUS培养液中培养2 h后移植。

解冻周期时,在月经周期的第2天开始子宫内膜准备,口服戊酸雌二醇6～8 mg/d。使用雌二醇引物约14～20 d,并用超声检查评估子宫内膜厚度。如果子宫内膜厚度为≥7 mm,则安排解冻移植,并在移植前3 d开始使用阴道微粉化孕酮,一直使用到妊娠9周,而戊酸雌二醇一直使用到确认出现胎心。

1.2.5 妊娠判断

临床妊娠是指在移植后6～7周,通过超声检查发现至少1个孕囊(包括异位妊娠),并伴有明显的胎心搏动。持续妊娠定义为妊娠12周之后的继续妊娠。流产定义为在22周之前临床妊娠的自发流产。

1.2.6 观察指标

观察指标主要包括累计妊娠率和累计活产率,其次为可利用胚胎率、流产率等。其他观察指标有年龄、BMI、AMH、AFC、不孕类型、卵子成熟率、受精率、正常受精率等。

相关定义及计算公式［6］:累计妊娠率=(新鲜周期+冷冻周期)首次获得妊娠的周期数/取卵周期数×100%;累计活产率=(新鲜周期+冷冻周期)首次获得活产的周期数/取卵周期数×100%。

1.3 统计学分析

连续变量的正态分布通常用均值±标准差来表示,而偏态分布则通常用M(P25,P75)来表示。使用方差分析(正态分布的连续变量)、Mann-WhitneyU检验(偏态分布的连续变量)或卡方检验(分类变量)对两组间人口统计学和临床数据的差异进行检验。

2 结果

2.1 基线资料比较

患者的基线资料如表1所示,本研究共纳入1 306例患者,将出现多原核受精的患者纳入多原核受精组(A组),无多原核受精的患者纳入正常受精组(B组),其中A组为388例,B组为918例。A组的AMH显著高于B组,而可利用胚胎数显著少于B组,两组间AFC和平均获卵数之间的差异均有统计学意义。

2.2 周期结局比较

通过对比表2中的周期结果指标发现,两组间的卵子成熟率、受精率、正常受精率、可利用胚胎率和移植胚胎总数差异均有统计学意义。A组的累计妊娠率小于B组,差异有统计学意义,累计活产率也小于B组但差异无统计学意义。

表1 两组患者基线资料比较Table 1 Comparison of baseline data between two groups of patients

表2 两组患者周期结局比较Table 2 Comparison of cycle outcomes between two groups of patients M(P25,P75)

2.3 可利用胚胎数助孕结局比较

根据可利用胚胎数分别比较了累计妊娠率和累计活产率,见表3及图1。结果显示,两组间的累计妊娠率和累计活产率存在显著的统计学差异。和可利用胚胎数为1个相比,可利用胚胎数越多,累计妊娠率及累计活产率越高,P<0.05;与可利用胚胎数为2个相比,可利用胚胎数为4及5个时,累计妊娠率显著上升,P<0.05;与可利用胚胎数为2个相比,可利用胚胎数为4个时,累计活产率显著上升,P<0.05;与可利用胚胎数为3个相比,可利用胚胎数为4个时,累计妊娠率及累计活产率显著上升,P<0.05。当可利用胚胎数增至4枚时,累计妊娠率和累计活产率达到平台期,与可利用胚胎数为5枚相当。

1)P<0.05

表3 可利用胚胎数助孕结局比较Table 3 Comparison of assisted pregnancy outcomes according to the number of available embryos n(%)

3 讨论

既往研究表明,AMH和 AFC在预测累积妊娠率方面具有相似的作用［7-9］。AMH是一个客观的检验指标,在一个周期治疗过程中能较客观较准确地预测获卵数,对周期结局如临床妊娠率、活产率等有较好的判断。但AFC容易受到超声仪器及超声医生的主观判断影响,较难统一判断标准及在不同临床试验中心进行比较。本研究发现多原核受精组的AMH显著高于正常受精组,而可利用胚胎数显著少于正常受精组,两组间的AFC和平均获卵数差异均有统计学意义。

IVF过程中的多原核受精是一种普遍存在的情况,它的出现概率介于1%～10%之间,但也可能会出现更高的比例［10］。在本研究中,大部分患者的年龄都超过了37岁,属于波塞冬标准［11］中的第4组人群,这组患者卵巢储备低,卵母细胞质量差,发生异常受精主要是由于卵母细胞缺陷的问题,并且无法通过二代试管婴儿技术解决［12］。随着妇女年龄的增长,卵子的质量会下降,非整倍体的比例会上升,线粒体的功能会减弱,甚至会失去极性,这些结构和功能的异常都会导致多原核受精［13］。Kotil等［14］研究了多原核受精卵母细胞的肌动蛋白丝,认为其肌动蛋白动力学可能受损,这种异常可能与卵母细胞质量差导致的细胞骨架改变有关。卵子的成熟程度也会对受精率产生重要的影响,从而使实际受精率和正常受精率之间存在着明显的差距,多精受精或双雄性三倍体引起的多原核受精可能是卵母细胞不成熟(导致皮质反应失败)、卵母细胞过熟和/或在授精量中存在极高浓度的活动精子的结果［15］。

目前,关于卵子数量降低是否会导致卵子质量下降的问题仍然存在争议。根据Figueira等［16］的研究结果,当卵巢反应不良的患者拥有卵子数量低于4个,并且年龄大于35岁时,受精率、优质胚胎率和种植率都没有显著的统计学变化,说明这些情况中的卵巢反应不良更多地会影响到胚胎的数量,而不是质量。本研究的患者大部分属于卵巢刺激低预后人群,该类患者平均年龄高,卵巢对药物的应答反应低,获卵数低,每一枚卵子都显得弥足珍贵,只要患者发生多原核受精,其异常受精率为20%～100%,可利用胚胎数目会迅速减少,从而减少了移植胚胎的成功可能性并降低了累计妊娠率和累计活产率,给患者造成了巨大的损失,本研究结果显示获卵数低的患者每增加1枚可利用胚胎,累计活产率可增加10%～20%,可大大改善这些患者的周期结局。

研究显示多精受精的频率越高,受精率、卵裂率、临床妊娠率和种植率也会有显著提升［17-19］。Shibahara等［20］和秦小娥等［21］的研究表明,多原核受精可以显著提升受精率,而且不会对种植率或临床妊娠率产生显著的负面影响。然而,在本研究中,多原核受精组的累计妊娠率显著小于正常受精组,累计活产率虽小于正常受精组,但差异无统计学意义,出现结果的不一致性可能与各研究的纳入人群不同及评估的指标有差异有关,多原核受精对周期结局的影响,还需更大样本的进一步研究来证实。

在本研究中,多原核受精组的可利用胚胎数显著少于正常受精组,对可利用胚胎数与累计妊娠率和累计活产率的关系进行统计分析,当可利用胚胎数为1～3枚时,随着可利用胚胎数的增加,累计妊娠率和累计活产率相应上升,但当可利用胚胎数增至4枚时,累计妊娠率和累计活产率达到平台期,与可利用胚胎数为5枚相当。本研究结果提示,当胚胎数量低于4枚时,可以采取全胚冷冻方案,并进行第2次卵巢刺激促排卵,以积累胚胎。然而,如果胚胎数量高于4枚,则可以考虑胚胎移植,以获得更稳定的累计妊娠率和累计活产率,这不仅能够减轻实验室和临床医生的工作压力,还能缓解患者的心理压力和经济负担。

总之,当患者卵子数量降低时,多原核受精会导致可用胚胎数量降低,从而降低胚胎移植的成功率,进而影响周期结局。因此,只有当可用胚胎数量高于4枚时,才能考虑进行胚胎移植,以获得较高的累计妊娠率和累计活产率。

作者贡献声明

宏苹苹:统计分析数据,撰写论文;李涛:数据评估、初稿的审阅修改;欧建平:提出研究思路和框架,修改论文;夏欣一:设计实验、提供基金资助及研究指导。

利益冲突声明

本研究未获得任何第三方资助,因此不存在任何潜在的利益冲突。