3 种核桃寄主对云斑天牛肠道可培养细菌多样性的影响

林叶邦，徐蕾，杨振德，3，韦善方

(1. 广西大学林学院，广西南宁 530000；2. 钦州市林业科学研究所，广西钦州 535000；3. 广西森林生态与保育重点实验室，广西南宁 530004；4. 巴马瑶族自治县自然资源局核桃产业发展中心，广西巴马 547500)

铁核桃(Juglans sigillataDode)属胡桃科(Juglandaceae)胡桃属(Juglans)植物，别名漾濞核桃、泡核桃等，主要分布在我国西南地区，为我国原产树种[1]。 铁核桃为优质的食用油原料，耐湿热不耐干旱，抗寒力弱，品种类型繁多，坚果大小和形状多种多样，品质优良，能够满足多种育种目标的需要[2]。 细香核桃(J.sigillatacv. ‘Xixiang’)、龙佳核桃(J.sigillatacv. ‘Niangqing’×J.sigillatacv. ‘Yangbidapao’)和娘青核桃(J.sigillatacv. ‘Niangqing’)均属铁核桃，具有较大的深加工价值，市场前景良好[3-5]。 云斑天牛(Batocera lineolata)属鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)昆虫，主要寄主有核桃(Juglans regis)、桉树(Eucalyptus robusta)、杨树(Populus tomentosa)、桑树(Morus alba)等，广泛分布于我国广东、广西、湖南、贵州、四川等多个省份和自治区[6]，对我国林业生态环境建设的发展造成严重影响，目前已经被定为高度危险性林业有害生物[7]。 调查发现，广西河池市多个县的核桃林出现了云斑天牛，对核桃树造成毁灭性伤害[8]。

昆虫体内存在大量微生物[9]。 研究表明，肠道微生物在昆虫的多种生命活动中都有参与，提高了昆虫的生态适应和生存能力[10]。 昆虫肠道微生物与宿主的相互作用主要体现于参与宿主食物消化、补给养分、提高宿主抗逆性以及影响宿主的寿命和繁殖能力[11-14]。 微生物在昆虫克服寄主防御中发挥重要作用，如红脂大小蠹(Dendroctonus valensLeConte)肠道细菌可以帮助昆虫降解寄主油松(Pinus tabuliformisCarrière)的单萜[15]；玉米根虫(Diabrotica virgifera virgiferaLeConte)肠道细菌可以促进其对玉米(Zea mays)和非寄主大豆(Glycine max)轮作的适应力[16]；桉树枝瘿姬小蜂(Leptocybe invasa)部分伴生细菌可降解桉树次生代谢物质来帮助小蜂克服植物抗性完成定殖等[17]。 许多研究表明，不同寄主植物会影响昆虫肠道微生物多样性，比如:桉树枝瘿姬小蜂分别取食巨园桉DH 201-2 和窿缘桉后体内细菌群落丰富度和多样性存在明显差异[18]；桃小食心虫(Carposina sasakiiMatsumura)在不同果园取食苹果和梨后，寄主植物和生境能够显著影响该虫的肠道菌群[19]。 为了探究不同寄主植物对云斑天牛肠道可培养细菌多样性的影响，本研究以云斑天牛成虫为材料，利用传统微生物分离技术与16S rDNA 序列分析相结合的方法，对分别取食3种不同品种核桃后云斑天牛肠道可培养细菌进行分离鉴定，为进一步研究云斑天牛肠道微生物菌群与寄主防御机制的相互关系及为选育对云斑天牛具有优良抗性的核桃优良品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试细香核桃、龙佳核桃和娘青均为1 年生嫁接苗，从广西河池市金城江区东江镇木友村(108°4＇E，24°45＇N)各取10 株，种植于广西大学林学院教学实践基地(108°17＇E，22°51＇N)。 砧木来源于云南省大理白族自治州漾濞彝族自治县漾江镇(99°56＇E，25°47＇N)，细香接穗来源于云南省保山市昌宁县柯街镇扁瓦村(99°31＇E，24°50＇N)，龙佳接穗来源于云南省大理白族自治州漾濞彝族自治县马厂乡马厂村马厂林场(99°59＇E，25°40＇N)，娘青接穗来源于云南省大理白族自治州漾濞彝族自治县太平乡太平村(99°52＇E，25°37＇N)。

试验用云斑天牛成虫采自广西河池市巴马瑶族自治县核桃种植基地(107°15＇E，24°9＇N)。

1.2 试验设计

参照胡建军等[20]的人工接虫方法。 将16 目铁丝网裁剪成60 cm × 50 cm 大小，在核桃树基部围成一个高约40 cm 的笼子，然后将云斑天牛成虫放入笼中用铁丝将笼子封严，1 个笼中放1 只云斑天牛，取食7 天，每个品种做3 个重复。

1.3 云斑天牛肠道可培养细菌的分离与纯化

试验前饥饿处理48 h，排空体内食物残渣。在超净工作台内将成虫完全浸泡于75%乙醇中5 min 进行体表消毒，之后用滤纸吸干表面残余液体，解剖出肠道移至玻璃匀浆器中加5 mL 无菌水，研磨充分后制成云斑天牛肠道匀浆液。

将制备好的肠道匀浆液按照10 倍梯度稀释方法制成10-1～10-7不同浓度的菌液，通过平板划线法在LB 培养基上进行分离纯化，得到单一菌落后把带菌平板送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行16S rDNA 测序。

1.4 系统发育分析

测序结果在NCBI 网站的GenBank 上进行BLAST 比对分析，将测序菌株鉴定至属。 将各菌株相对应Blast 结果中一致性最高的菌株序列下载，利用MEGA 11.0 软件中Neighbor-Joining(NJ)法(bootstrap 设置为1000)构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 不同品种核桃对云斑天牛成虫肠道细菌组成的影响

利用LB 培养基，从取食3 种核桃的云斑天牛成虫肠道中分离得到19 株可培养细菌。 NCBI数据库比对结果(表1)表明，从取食龙佳核桃的云斑天牛成虫肠道中分离出可培养细菌5 株，分属于5 个属，分别是拉乌尔菌属(Raoultella)、肠球菌属(Enterococcus)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属(Enterobacter)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)；从取食娘青核桃的云斑天牛成虫肠道中分离出可培养细菌7 株，分属于7 个属，分别是拉乌尔菌属、肠球菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳球菌属(Lactococcus)和泛菌属(Pantoea)；从取食细香核桃的云斑天牛成虫肠道中分离出可培养细菌7 株，分属于7 个属，分别是拉乌尔菌属、肠球菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、Gibbsiella属、泛菌属和假单胞菌属。

表1 云斑天牛成虫肠道可培养细菌的分离鉴定

将3 组云斑天牛成虫肠道分离得到的菌属绘制成韦恩图，结果(图1)表明，这些菌属中有3 个属是共有的，取食娘青和细香核桃的云斑天牛分别分离出1 种特有菌属。

图1 取食不同核桃品种的云斑天牛成虫肠道可培养细菌群落结构韦恩图

2.2 系统发育分析

对测序得到的云斑天牛成虫肠道可培养细菌的16S rDNA 序列进行系统进化分析。 结果表明，LJ1-9 菌株属于厚壁菌门，LJ1-12、LJ3-8、LJ3-13和LJ1-11 菌株属于变形菌门(图2)；NQ1-18 和NQ2-2 菌株属于厚壁菌门，NQ1-2、NQ2-9、NQ2-7、NQ2-17 和NQ1-20 菌株属于变形菌门(图3)； XX2-13 菌株属于厚壁菌门，XX1-9、XX1-7、XX3-4、XX1-13、XX3-17 和XX2-4 菌株属于变形菌门(图4)。 表明变形菌门是取食3 种核桃后云斑天牛成虫肠道可培养细菌的优势菌群。

图2 基于16S rDNA 序列取食龙佳核桃后云斑天牛成虫肠道内可培养细菌系统发育进化树

图3 基于16S rDNA 序列取食娘青核桃后云斑天牛成虫肠道内可培养细菌系统发育进化树

图4 基于16S rDNA 序列取食细香核桃后云斑天牛成虫肠道内可培养细菌系统发育进化树

3 讨论与结论

本试验结果表明，取食3 个品种核桃的云斑天牛成虫肠道中可培养细菌在门分类水平上均为变形菌门和厚壁菌门，且变形菌门为优势菌门。众多研究表明，大部分鳞翅目与鞘翅目昆虫肠道中可培养细菌均属于变形菌门和厚壁菌门，推测它们可能在昆虫的生命活动中发挥重要作用。 在小菜蛾[Plutella xylostella( L.)][21]、仁扇舟蛾(Clostera restitura)[22]、松褐天牛(Monochamus alternatus)[23]、桑天牛(Apriona germari)[24]、新西兰助翅鳃金龟(Costelytra zealandica)[25]等昆虫肠道中的可培养细菌优势菌门也均为变形菌门，证明不同昆虫之间的肠道可培养细菌种类存在一定的相似性。

食物为昆虫体内微生物多样性的重要影响因子之一[26]。 本研究发现取食不同核桃的云斑天牛成虫肠道可培养细菌的组成存在明显差异。 取食龙佳核桃的云斑天牛成虫肠道中分离出的菌属最少；取食娘青核桃和细香核桃的云斑天牛分离出来的菌属数量相等，但在菌属组成上存在差异。已有研究表明，一些植物的次生代谢物质，如丹宁[27]、黄酮[28]和一些酚类物质[29]等均会对细菌的生长发育产生影响，因此推测造成取食不同寄主植物的云斑天牛肠道可培养菌属组成存在差异的原因是不同寄主植物的次生代谢物质的含量存在差别。

在本研究中，拉乌尔菌属、肠球菌属和克雷伯氏菌属为3 个处理中的共有菌属，这3 个属可能对维持取食核桃的云斑天牛成虫的生理代谢活动具有特殊影响。 相对于取食娘青核桃和细香核桃的云斑天牛来说，取食龙佳核桃的云斑天牛成虫肠道未分离出假单胞菌属和泛菌属菌株。 有研究指出从感染溃疡病的猕猴桃组织中分离出假单胞菌属菌株[30，31]；从感染核桃细菌性黑斑病的组织中分离出泛菌属菌株[32]，表明这两个属中存在植物致病菌，本次研究分离出来的假单胞菌属和泛菌属的菌株对取食寄主是否有致病力还需进一步研究。 取食细香核桃的云斑天牛成虫肠道中分离出来特有菌属Gibbsiella，目前国内对该菌的研究较少。 周会先等[33]对普氏蹄蝠(Hipposideros pratti)进行肠道细菌多样性研究时发现了Gibbsiella属细菌的存在，他提出普氏蹄蝠胃肠道中存在的大部分细菌属于致病菌，且对人类与动物有害，因此推测Gibbsiella属细菌也是属于致病菌的一种；此外在取食桉树的云斑天牛幼虫肠道中也分离出该属菌株[34]。 在国外研究中，从有树皮裂纹等病害症状的栓皮栎(Quercus roburL.)中分离出了Gibbsiella属细菌，发现该菌与急性栎树衰退(AOD)有关[35]；伊朗也发现了一种新的栎树(Quercusspp.)病害，发现Gibbsiella菌是与栎树茎出血症和溃疡病有关的潜在致病菌[36]；伊朗西北部爆发的一种核桃新发疾病，经鉴定为Gibbsiella quercinecans引起的核桃细菌性溃疡病[37]。 至于该菌是天牛肠道中的共生菌还是通过取食寄主后进入到体内的、在天牛肠道中起到什么作用、Gibbsiella属细菌的具体功能等还需进一步研究。

综上所述，不同核桃寄主植物能够对云斑天牛成虫肠道细菌的多样性产生影响，这些细菌是否能够对云斑天牛的生命活动产生影响及是否会对寄主植物造成二次伤害，还有待后续研究。