基于UPLC-Q-TOF-MS和网络药理学探讨丝穗金粟兰水提物抗炎镇痛药效物质及作用机制

甄丹丹，黄耀斌，卢显兴，陈景敏，丘 琴，张 淼，史俊豪

基于UPLC-Q-TOF-MS和网络药理学探讨丝穗金粟兰水提物抗炎镇痛药效物质及作用机制

甄丹丹1，黄耀斌2#，卢显兴3，陈景敏4*，丘 琴1，张 淼1，史俊豪1

1. 广西中医药大学，广西 南宁 530022 2. 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530200 3. 广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530200 4. 玉林市中医医院，广西 玉林 537100

利用高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱法（UPLC-Q-TOF-MS）分析丝穗金粟兰水提物的主要成分，并结合网络药理学的方法对其抗炎镇痛药效物质及作用机制进行预测分析。结合ChemSpider数据库、mzCloud平台及现有文献研究，对目标化合物二级质谱特征碎片离子进行比对确认，鉴定丝穗金粟兰水提物的化学成分；通过FAFDrug4数据库筛选丝穗金粟兰水提物的活性成分，运用Pharmmapper平台和Uniprot数据库预测丝穗金粟兰的成分靶点，GeneCards平台获得相关疾病靶点，利用Venny平台获得成分和疾病的交集靶点；通过String数据库和Cytoscape3.7.0软件构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，并筛选核心靶点，利用David数据库对潜在的核心靶点进行基因本体（gene ontology，GO）功能和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并构建“活性成分-靶点-通路”网络。从丝穗金粟兰水提物中共鉴定45个成分，包括有机酸类、黄酮类、香豆素类、倍半萜类、含氮类化合物；筛选出33种活性成分，活性成分与疾病交集靶点70个；通过PPI网络筛选出核心靶点13个；富集分析显示，丝穗金粟兰主要参与蛋白磷酸酶结合、胰岛素受体结合、蛋白激酶活性等功能，通过酪氨酸激酶受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、酪氨酸激酶抑制剂耐药等通路抗炎镇痛。通过对“活性成分-靶点-通路”网络分析进一步得到5个关键靶点和8个关键活性成分。通过结合UPLC-Q-TOF-MS和网络药理学的方法阐明了丝穗金粟兰是通过多成分、多靶点、多途径发挥抗炎镇痛的作用，为丝穗金粟兰的进一步质量评价及药理活性的研究提供参考。

丝穗金粟兰；抗炎镇痛；活性成分；药效物质基础；UPLC-Q-TOF-MS；网络药理学；木犀草素；绿原酸；新绿原酸；迷迭香酸；依斯坦布林A；莽草酸；石竹素；原儿茶酸

丝穗金粟兰为金粟兰属植物丝穗金粟兰(A. Gray) Solms-Laub的全草，有祛风散寒、活血止痛、解毒消肿的功效，适用于治疗类风湿关节炎、跌打肿痛、慢性肠胃炎、疮疖肿毒等。目前对其抗炎镇痛药效物质基础的研究鲜有报道。中药化学成分复杂，传统的鉴别方法在未知成分的结构解析方面存在一定困难。液质联用技术将液相与质谱的优势相结合，可以快速分离和鉴定中药中的复杂成分，在中药的成分分析、质量控制及中药血清药物化学方面具有一定优势[1]。网络药理学是大数据背景下的产物，融合了多门学科的概念和方法，通过构建“药物活性成分-疾病-靶点”网络，可以从整体上分析多成分中药的作用机制。因此，广泛运用于中药或民族药的研究中[2-3]。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术对丝穗金粟兰水提物中的化学成分进行解析并采用网络药理学的方法对其抗炎和镇痛潜在药效物质及作用机制进行预测，为丝穗金粟兰今后药理活性及质量标准的研究提供数据支撑。

1 材料

1.1 药材与试剂

丝穗金粟兰采自广西来宾市金秀县，经广西中医药大学朱意麟实验师鉴定为金粟兰属植物丝穗金粟兰(A. Gray) Solms-Laub的全草。乙腈和甲醇均为质谱纯，购自美国Thermo Fisher Scientific公司；水为超纯水，购自美国默克公司；甲酸和乙酸铵均为质谱纯，购自上海安谱科学仪器有限公司。

1.2 仪器

TripleTOF 5600型高分辨质谱仪（美国SCIEX公司）；UltiMate 3000型超高效液相色谱（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

取丝穗金粟兰药材剪碎成1 cm大小，称取500 g，加入10倍量蒸馏水浸泡30 min，回流提取2次，每次1.5 h，用医疗纱布滤过，合并2次滤液并浓缩成浸膏，精密称取丝穗金粟兰水提物浸膏250 mg，转移置10 mL量瓶中并加入50%甲醇溶液，定容至刻度，超声15 min，滤过后滤液经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2 色谱条件

Acquity UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；正离子模式流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），负离子模式流动相为2 mmol/L乙酸铵溶液（A）-乙腈（B）。正、负离子均梯度洗脱：0～1.5 min，5% B；1.5～2.5 min，5%～10% B；2.5～14 min，10%～40% B；14～22 min，40%～95% B；22～25 min，95% B；25～26 min，95%～5% B；26～30 min，5% B。体积流量0.4 mL/min；柱温40 ℃；进样量3 μL。

2.3 质谱条件

电喷雾离子源；雾化气压60 psi（1 psi＝6.895 kPa）；辅助气压60 psi；气帘气压35 psi；温度650 ℃；喷雾电压5000 V（正离子模式）或−4000 V（负离子模式），在每个数据采集循环中，筛选出强度最强且大于100的分子离子进行采集对应的二级质谱数据。一级采集范围/50～1200，轰击能量30 eV，每50毫秒采集10张二级谱图。

2.4 丝穗金粟兰活性成分和靶点筛选

将解析得到的丝穗金粟兰成分上传至FAFDrug4（fafdrugs4.rpbs.univ-paris-diderot.fr）数据库进行活性成分的筛选[4]。

2.5 炎症和疼痛的靶点筛选

将获取的丝穗金粟兰活性成分导入Pharmmapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）平台预测潜在的作用靶点，使用UniProt（http://www.uniprot.org/）平台进行校正。采用GeneCards（http://www.genecards.org/）平台，分别以炎症（inflammation）和疼痛（pain）为检索词，进行搜索，获得疾病靶点，并分别取前10%作为候选靶点，利用Venny平台获得成分和疾病的交集靶点作为潜在抗炎和镇痛的药效靶点。

2.6 交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建及富集分析

将交集靶点上传String（https://string-db.org/）数据库，筛选条件为“Homo sapien”，置信度为0.9，构建PPI网络。利用Cytoscape 3.7.0软件中Network Analyer插件进行分析，获取丝穗金粟兰抗炎镇痛的核心靶点，筛选条件为大于介数中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）和度值这3项的平均值。利用David数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对潜在的核心靶点进行基因本体（gene ontology，GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2.7 “活性成分-靶点-通路”网络构建

将核心靶点、与核心靶点相关的活性成分、关键通路导入到Cytoscape 3.7.0软件中，构建“活性成分-靶点-通路”网络，并以高于BC、CC和度值这3项的平均值为条件筛选出核心成分。

3 结果

3.1 丝穗金粟兰水提物成分分析

将丝穗金粟兰水提物样品按“2.2”“2.3”项下条件进行分析，得到丝穗金粟兰水提物样品在正、负离子模式下的总离子流图，见图1。采用Peakview1.2计算分子式，对比理论值和实际值，结合ChemSpider、mzCloud和维谱数据库及现有文献研究，从丝穗金粟兰水提物中共推测了45个成分，其中有机酸25个、黄酮类3个、香豆素类7个、倍半萜5个、含氮类有机物5个，具体信息见表1。

图1 正 (A)、负 (B) 离子模式下丝穗金粟兰水提取物的总离子流图

3.2 网络药理学预测分析

3.2.1 丝穗金粟兰活性成分的筛选及药效靶点的预测 基于UPLC-Q-TOF-MS的分析结果得到丝穗金粟兰成分45种，经FAFDrugs4数据库筛选，获得33种主要活性成分（表1），包括绿原酸、新绿原酸、迷迭香酸等。将上述33种活性成分导入到Pharmmapper数据库，并利用UniProt数据库进行查询，去重后共收集到457个靶点。

3.2.2 炎症和疼痛相关靶点筛选 在GeneCards数据库中检索获得与炎症相关的靶点1090个，与疼痛相关的靶点1218个。与活性成分457个靶点匹配后，交集得到70个丝穗金粟兰抗炎镇痛的潜在作用靶点，见图2。

表1 丝穗金粟兰水提取物中化学成分的鉴定

a～e依次为有机酸类、黄酮类、香豆素类、倍半萜类、含氮类化合物

a—e are organic acids, flavonoids, coumarins, sesquiterpenes and nitrogenous compounds

图2 丝穗金粟兰活性成分-抗炎镇痛靶点Venn图

3.2.3 PPI网络 将上述活性成分抗炎镇痛的70个潜在作用靶点导入STRING数据库平台，得到由54个节点及182条边组成的PPI网络，见图3，节点代表潜在作用靶点，图中节点越大表示该节点度值越大。进一步应用Cytoscape 3.7.0软件计算网络节点的拓扑参数，度值、BC、CC的平均数依次为6.740、0.028、0.418，基于以上3个参数进行筛选，最终得到13个核心靶点，见表2。

3.2.4 GO功能富集分析 通过David数据平台对13个核心靶点进行生物功能分析，以＜0.01为条件，共筛选得到189个GO条目，其中生物过程139条、细胞组成22条、分子功能27条。将生物过程、分子功能和细胞组成中排名前10的条目绘制成图（图4），基因数代表主要活性成分富集在该通路下的靶点数目。结果显示，生物过程方面，丝穗金粟兰活性成分主要参与蛋白磷酸酶结合、胰岛素受体结合、蛋白激酶活性等；细胞组成方面，主要参与细胞核、线粒体、分子复合物等；分子功能主要涉及血小板激活、信号传导、凋亡过程的负调控等。综上所述，丝穗金粟兰的活性成分可通过调控多种生物学途径联合发挥抗炎镇痛作用。

图3 PPI网络

表2 核心靶点

图4 GO功能富集分析 (前10)

3.2.5 KEGG通路富集分析 通过David数据平台将潜在作用靶点与KEGG信号通路进行匹配，以＜0.01为筛选条件，共富集得到信号转导Ras信号通路、酪氨酸激酶受体ErbB2信号通路、FoxO信号通路等128条。结合文献研究，筛选出值最小的前16条信号通路进行后续研究，并绘制气泡图（图5）。图中节点越大，表示富集在这条通路上的靶点数量越多。

3.2.6 “活性成分-靶点-通路”网络 将丝穗金粟兰活性成分、潜在靶点、前16条KEGG通路导入到Cytoscape 3.7.0软件，构建“活性成分-靶点-通路”网络见图6。该网络共有62个节点，321条相互作用连线，其中红色节点代表活性成分，共33个；黄色节点代表13个核心潜在作用靶点；紫色节点代表通路，共16条。节点越大，度值越高。应用Network Analyzer分析对网络进行分析，活性成分的度值、BC、CC的平均数依次为6.727、0.004、0.501；关键靶点的度值、BC、CC的平均数依次为24.692、0.063、0.521。基于以上3个参数进行筛选，最终得到5个核心靶点，依次为蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶14（mitogen- activated protein kinase 14，MAPK14）、非受体酪氨酸激酶（sarcoma receptor coactivator，SRC）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和内糖苷酶F2；8个关键活性成分，分别为木犀草素、绿原酸、新绿原酸、迷迭香酸、依斯坦布林A、莽草酸、石竹素和原儿茶酸。通过分析网络图发现，丝穗金粟兰活性成分中，同一活性成分能同时作用于多个靶点，而相同靶点亦对应多种活性成分，说明丝穗金粟兰化学成分能够多成分、多靶点发挥治疗抗炎和镇痛作用。

图5 KEGG通路富集分析(前16)

图6 “活性成分-靶点-通路”网络

4 讨论

本研究通过UPLC-Q-TOF-MS技术从丝穗金粟兰水提物中解析出45种化学成分，其中有机酸25个、黄酮类3个、香豆素类7个、倍半萜5个、含氮类有机物5个。运用网络药理学的方法，本研究共筛选出丝穗金粟兰水提物活性成分33个，与抗炎镇痛相关的靶点70个，涉及AKT1、F2、MAPK14、SRC、EGFR、ErbB2、胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，CASP3）、MAPK8等核心靶点，说明丝穗金粟兰发挥抗炎和镇痛作用具有多成分、多靶点的优势。针对上述“活性成分-靶点-通路”网络分析，发现原儿茶酸、木犀草素、绿原酸、新绿原酸、迷迭香酸、依斯坦布林A、莽草酸、石竹素8个活性成分在网络中度值较大。研究表明，原儿茶酸可以抑制肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6的分泌，对多数炎症性疾病有一定治疗作用[33-34]。绿原酸类成分是具有解热、镇痛、抗炎作用的一类成分，能够通过抑制Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/ 核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路的激活，从而减轻炎症的发生[35]。此外，绿原酸与AKT1、CASP3、F2、IGF1、MAPK14、MAPK8、磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）、SRC这8个靶点有关联。此外，原儿茶酸也可以通过调节沉默信息调节因子1（SIRT1）/NF-κB途径抑制脂多糖激活的BV2小胶质细胞的炎症反应[36]。通过PPI网络分析可知SRC、MAPK1、PIK3R1、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型11（protein tyrosine phosphatase nonreceptor 11，PTPN11）、MAPK8、EGFR、AKT1、IGF1在网络中所占的度值较大，极可能为丝穗金粟兰治疗炎症和疼痛性疾病过程中发挥重要作用的关键靶标。

为进一步研究丝穗金粟兰抗炎镇痛的潜在机制，对PPI网络筛选出的13个核心靶点通路富集分析得到128个富集条目，其中ErbB信号通路、TNF信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药等条目值显著性较高（＜0.01），可能为其发挥抗炎镇痛作用重要通路之一。TNF是一种促炎细胞因子，其异常分泌可导致炎症的发生，研究表明可以通过调控TNF信号通路发挥抗炎镇痛的作用[37]。免疫系统的细胞表达存在各种模式识别受体，这些受体在清除病原体时会存在无法区分自身和非自身分子，持续的TLR信号传导会导致炎症性疾病。TLR是最显著的模式识别受体，其在对病原体感应时会引起炎症反应，TLR拮抗剂的开发是目前免疫疾病研究的热点[38]。本研究发现13个潜在靶点中有3个富集在Toll样信号通路上，分别为MAPK8、MAPK1、AKT1、PIK3R1、MAPK14，可能为丝穗金粟兰调控该通路的关键靶点。

综上，丝穗金粟兰可能通过原儿茶酸、木犀草素、绿原酸、新绿原酸、迷迭香酸、依斯坦布林A、隐绿原酸等33个成分调控SRC、MAPK1、PIK3R1、PTPN11、MAPK8、EGFR、AKT1、IGF等13个核心靶点进而影响ErbB信号通路、TNF信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药等16条通路来发挥抗炎镇痛作用。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Anti-inflammatory and analgesic substances and mechanisms of aqueous extracts ofbased on UPLC-Q-TOF-MS and network pharmacology

ZHEN Dan-dan1, HUANG Yao-bin2, LU Xian-xing3, CHEN Jing-min4, QIU Qin1, ZHANG Miao1, SHI Jun-hao1

1. Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530022, China 2. The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 3. Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 4. Yulin Hospital of Traditional Chinese Medicine, Yulin 537100, China

To analyze the main components of the aqueous extract ofby ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS), and predict its anti-inflammatory and analgesic potent substances and mechanisms by combining network pharmacology methods.Based on ChemSpider database, mzCloud platform and existing literature research, the secondary mass spectra of target compounds were compared and confirmed to identify the chemical composition of the aqueous extracts of. The active ingredients of the aqueous extracts ofwere screened by the FAFDrug4 database. The constituent targets ofwere predicted using the Pharmmapper platform and Uniprot database. The relevant disease targets were obtained using GeneCards platform, and the intersection targets of constituents and diseases were obtained using Venny platform. PPI network was constructed by using String database and Cytoscape 3.7.0 software, and the core targets were screened. Gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis of potential core targets were performed by using David database, and “active ingredient-target-pathway” network was constructed.A total of 45 components, including organic acids, flavonoids, coumarins, sesquiterpenoids and nitrogen-containing compounds, were identified from the aqueous extracts of. A total of 33 active components were screened and 70 active components and disease intersection targets were identified. A total of 13 core targets were screened through PPI network. Enrichment analysis showed thatmainly participated in protein phosphatase binding, insulin receptor binding, protein kinase activity and other functions, and presented the effects of resisting inflammation and pain through tyrosine kinase receptor signaling pathway, tumor necrosis factor signaling pathway, tyrosine kinase inhibitor resistance and other pathways. Five key targets and eight key active components were further obtained through the analysis of the “active ingredient-target-pathway” network.By combining UPLC-Q-TOF-MS and network pharmacology, it is clarified thatplays an anti-inflammatory and analgesic role through multi-component, multi-target and multi-channel, which provides reference for further quality evaluation and pharmacological activity research of.

(A. Gray) Solms-Laub; anti-inflammatory and analgesic activity; active components; pharmacophore basis; UPLC-Q-TOF-MS; network pharmacology; luteolin; chlorogenic acid; neochlorogenic acid; rosmarinic acid; istanbulin A; shikimic acid; epoxycaryophyllene; protocatechuic acid

R285.5

A

0253 - 2670(2023)12 - 3903 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.017

2022-12-01

广西中医药大学“桂派杏林青年英才”培养项目（2022C032）；中药学广西一流学科（桂教科研[2018]12号）；壮瑶药协同创新中心（桂教科研[2013]20号）；广西壮瑶药重点实验室（桂科基字[2014]32号）；广西八桂学者中药创新理论与药效研究项目（J13162）；广西重点学科壮药学（桂教科研[2013]16号）；国家重点研发计划资助项目（2019YFC1712300）

甄丹丹（1983—），女，硕士，助理研究员，从事中药与药学的科研与教学。E-mail: 8zhen@163.com

通信作者：陈景敏（1975—），女，本科，副主任护师，从事脑病临床护理和医院药学工作。E-mail: 294363022@qq.com

#共同第一作者：黄耀斌（1983—），男，本科，主管中药师，从事药学科研和医院药学工作。E-mail: 350365847@qq.com

[责任编辑 李亚楠]