基于超快速VPCR荧光可视化检测技术的小檗皮及其藏成药中原料药的真伪鉴别研究

李红颖，宋文俊，李慧林，张继晨，范 刚，陈 蓉

基于超快速VPCR荧光可视化检测技术的小檗皮及其藏成药中原料药的真伪鉴别研究

李红颖1，宋文俊2，李慧林1，张继晨3，范 刚2*，陈 蓉2*

1. 成都中医药大学药学院，四川 成都 611137 2. 成都中医药大学民族医药学院，四川 成都 611137 3. 四川天府新区新经济发展研究中心，四川 成都 610299

建立藏药小檗皮及藏成药中小檗皮特异性DNA的超快速荧光可视化检测方法，实现对小檗皮药材及藏成药中小檗皮的快速鉴别。将小檗皮及其混淆品的ITS2序列进行比对，筛选出小檗皮药材特异性DNA序列；针对该序列设计小檗皮特异性引物，建立小檗皮药材以及藏成药中小檗皮特异性DNA的超快速VPCR扩增体系；后将该扩增体系与SYBR Green I荧光染料相结合，实现对扩增产物的荧光可视化检测；同时对该体系的特异性、灵敏度以及在真实样本中的适用性进行考察。该体系可以在40 min内完成对小檗皮以及藏成药中小檗皮特异性DNA的扩增及荧光可视化检测；检测限低至10 pg/μL；对16个批次的小檗皮药材进行分析，其中15个批次的样本产生阳性信号鉴定为小檗皮，与测序结果100%一致，1个批次的样本产生阴性信号，该样本经通用引物测序鉴定为黄柏；对3种含有小檗皮的藏成药进行分析，3个样本均产生阳性信号。所建方法缩短了检测时间，并且特异性良好，灵敏度高，可以对小檗皮及其藏成药中小檗皮进行快速、准确的可视化鉴别。

小檗皮；VPCR；快速扩增；可视化检测；藏成药

藏医药是中国传统医学宝库的重要组成部分，在藏族几千年的发展历史当中一直发挥着重要的作用，由于生长环境的特殊性，藏药通常有着特殊的疗效，吸引了国内外学者的广泛关注。小檗皮（藏文译音：给尔驯、吉尔哇、杰星等）始载于《四部医典》[1]，是藏医临床治疗“京尼萨库”病（糖尿病）及其并发症的常用药[2]，现代药理学研究发现，小檗皮能改善糖尿病肾病的病理变化和药效学指标[3-6]。小檗皮目前尚未被收入《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药分册》标准正文，仅在标准附录中规定其来源为小檗科植物甘肃小檗Schneid.及其同属多种植物的干燥内皮。此外，小檗皮还常作为原料药在多种藏成药中使用，如四味姜黄汤散、八味小檗皮散的处方中均使用了大剂量的小檗皮[7]。

小檗属植物约有500余种，广泛分布于世界各地，我国大约有200种，根据文献记载和实际调查研究发现[8]，我国目前药材市场、藏医院和藏药厂使用的小檗皮主流品种为甘肃小檗Schneid.、鲜黄小檗Maxim.、匙叶小檗Schneid.以及刺红珠Franch.。由于芸香科黄皮树Schneid.的干燥树皮黄柏与小檗皮的外形十分相似，市场上常出现以黄柏掺入小檗皮混用的情况，严重影响了药材的质量和临床疗效。此外，小檗皮作为一种常用藏药材，在多种藏成药中使用，藏成药通常是由几味甚至几十味药材组成，化学成分十分复杂，药材粉碎以后也不能从外观性状上进行鉴别，所以藏成药中原料药的真伪鉴别则更加充满挑战。

DNA分子非常稳定，不受药材生长环境、采摘时间、产地等影响，可以清晰准确的提供药材或者成药当中原料药的物种信息，以DNA条形码、位点特异性PCR为代表的DNA分子鉴定技术已经被广泛地应用于多种中药材[9-12]以及中成药中原料药的真伪鉴别[13-14]；川贝母、乌梢蛇、蕲蛇、石斛等药材的PCR鉴别法也已被《中国药典》2020年版收载[15]。目前PCR扩增常用的方法包括三步法和两步法（图1），三步法在变性、退火、延伸3个温度点分别停留一定的时间来确保核酸分子的扩增；两步法则是将退火和延伸2个步骤合二为一，但在高低两个温度点仍旧保持15～45 s的停留时间；课题组在前期的研究中发现，PCR过程并不需要在固定温度点的时间停留，反应体系只需要在高低2个温度点之间进行往复升降温，扩增过程就能够在动态的升降温过程中完成。这样的加热方式可以将DNA扩增的时间从原来的1 h以上缩短至20～30 min以内，由于体系的温度-时间曲线图中呈现多个“V”型，所以此方法被命名为“VPCR”[16-18]。SYBR Green I是一种灵敏度非常高的双链DNA荧光染料，在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，与双链DNA结合后，荧光大大增强，在紫外灯下呈现肉眼可见的绿色荧光。所以本研究将VPCR扩增与SYBR Green I荧光染料相结合，通过VPCR实现小檗皮特异性DNA的快速扩增，再将SYBR Green I染料加入到VPCR扩增产物中，实现对扩增产物的荧光可视化检测[19-20]。该体系反应时间短，整个扩增和检测过程可在40 min内完成，特异性好，灵敏度高，不仅可以应用于小檗皮药材的真伪鉴别，还可以应用于藏成药中小檗皮的定性鉴别，期望可以对制药企业产品的质量控制、监管部门的快速检测提供参考。

图1 3种PCR体系的温度-时间曲线图

1 材料与仪器

1.1 材料

本研究建立方法时所使用的4批小檗皮基原植物由成都中医药大学范刚教授鉴定且经DNA条形码验证，用于方法适用性考察的16批小檗皮药材以及3种含有小檗皮的藏成药购自各大藏医院及药材市场，所有样品详细信息见表1，小檗皮药材、混淆品黄柏药材、藏成药照片见图2。

表1 所用药材及藏成药信息

1～4-4种小檗皮基原植物 5～20-小檗皮待测药材 21～23-待测藏成药

1—4-four different original plants of5—20-the tested medicinal materials of21—23-the tested Tibetan patent medicine

图2 小檗皮、黄柏药材以及待测藏成药

1.2 试剂与仪器

LifeTouch型基因扩增仪（杭州博日科技股份有限公司），DYY-6C型电泳仪电源（北京六一生物科技有限公司），JY04S-3C型凝胶电泳成像系统（北京君意东方电泳设备有限公司），H1650-K型台式微量高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），S1010型掌上离心机（SCILOGEX），XW-80A型旋涡混合器（上海驰唐电子有限公司），ThermoCell MixingBlock型振荡恒温金属浴（杭州博日科技股份有限公司），ZF-90型多功能暗箱式紫外透射仪（上海宝山顾村电光仪器厂）。

DNA聚合酶（货号：AP111）购自北京全式金生物技术有限公司。Marker（货号B500350）、琼脂糖（A620014）、10 mmol/L dNTP Mixture Solution（B500056）和50×TAE缓冲液（B548101）均购于生工生物工程（上海）股份有限公司，50X TAE缓冲液使用前用H2O稀释成1×的工作液。Goldview I型核酸染料（货号：G8140）购于北京索莱宝科技有限公司。SYBR Green Ⅰ核酸染料（货号：S7563）购于Invitrogen，使用前用DMSO稀释成500×的工作液。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并纯化（HAP纯化），超纯灭菌水溶解，−20 ℃保存。植物基因组DNA提取试剂盒（货号：DE-06111）购于成都福际生物技术有限公司。

2 方法

2.1 DNA的提取

取药材或藏成药样品适量，研磨均匀后分别置于1.5 mL离心管中，采用植物DNA提取试剂盒提取样品DNA，利用超微量紫外可见分光光度计测定DNA提取液的浓度和纯度，并用通用引物对成药DNA模板的质量进行检验。DNA提取液置于−20 ℃保存备用。

2.2 ITS2序列扩增及检测

将4种小檗皮基原植物和黄柏的DNA提取物用ITS2序列的通用引物[21]S2F（5’-ATGCGAT- ACTTGGTGTGAAT-3’）和S3R（5’-GACGCTT- CTCCAGACTACAAT-3’）进行PCR扩增。反应总体系为25 μL，包括10×buffer缓冲液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，引物各1 μL，0.5 μL，DNA提取液1 μL，加灭菌水补足25 μL。藏成药扩增体系总体积仍为25 μL，其中将DNA提取液增加至2 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性90 s；95 ℃变性10 s，55 ℃复性10 s，72 ℃延伸45 s，30个循环。反应结束后取各PCR产物5 μL，与1 μL 6×DNA上样缓冲液混合后点样，在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，200 V电压下电泳8 min，在凝胶成像仪下观察并采集图像，出现明亮清晰的条带即为扩增成功，将扩增成功的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。

2.3 特异性引物的设计

利用LaserGene软件中Megalign对测序得到的4种小檗皮及混淆品黄柏的ITS2序列进行分析，根据序列对比结果找出其稳定变异位点，采用Primer Premier 5.0软件设计出能够扩增4种小檗皮药材的特异性引物，同时经过BLAST发现，小檗属植物的序列相似度极高，本实验设计的引物也可以扩增同属的其他多种小檗皮，即可应用于其他同属小檗皮药材的鉴定。

2.4 VPCR荧光可视化检测体系的建立

以“2.1”项下制备的DNA作为模板，采用小檗皮特异性引物进行VPCR扩增，反应总体系为25 μL，包括10×buffer缓冲液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，引物各1 μL，0.5 μL，DNA 5 μL，加灭菌水补足25 μL。VPCR反应体系：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性0.1 s，55 ℃复性0.1 s，35个循环。反应结束后取各PCR产物5 μL，与1 μL 6×DNA上样缓冲液混合后点样，在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，200 V电压下电泳8 min，在凝胶成像仪下观察并采集图像；荧光可视化检测则直接向PCR产物中加入1 µL 500×SYBR Green I型荧光染料，混匀，在365 nm紫外光下观察并拍照记录。

3 结果与分析

3.1 序列对比以及特异性引物的设计

4种基原植物和黄柏测序所得序列与GenBank中所登记序列一致，且对比结果显示4种小檗皮之间的序列差异较小，但是与混淆品黄柏序列差异较大，比对结果如图3所示。利用Primer Premier 5.0软件，结合引物设计原则，设计出能够同时扩增4种小檗皮，但不能扩增黄柏的特异性引物XBPa-F（5’-CCTAAATGATGGCCTCGA-3’）和XBPa-R（5’-ACAAGGGTTTGTACAGCT-3’），引物扩增后片段大小为112 bp。

图3 小檗皮主流品种和黄柏的ITS2序列分析

3.2 VPCR荧光可视化检测体系的建立以及特异性考察

利用“2.4”项下的方法对我国使用的4个小檗皮主流品种（匙叶小檗、鲜黄小檗、甘肃小檗、刺红珠）以及常见的混淆品黄柏的基因组DNA进行扩增和检测，建立VPCR荧光可视化检测体系，同时考察体系的特异性。实验结果如图4所示，4种小檗皮在112 bp处可出现清晰明亮的特异性扩增条带，黄柏样品不出现扩增条带；在荧光检测图中，只有4种小檗皮样品发出绿色荧光，黄柏样品不出现荧光，表明VPCR荧光检测体系特异性良好，结果直观，可以明确区分小檗皮及常见混淆品黄柏。

NC-阴性对照 1-黄柏 2-匙叶小檗 3-鲜黄小檗 4-甘肃小檗 5-刺红珠 M-Marker

3.3 VPCR荧光可视化检测体系的灵敏度考察

将等量的4种小檗皮DNA提取液充分混匀，稀释成不同质量浓度的提取液，利用小檗皮特异性引物分别对质量浓度为1～1×104pg/μL的小檗皮DNA提取液进行VPCR荧光检测，检测结果如图5所示，当模板质量浓度为100～1×104pg/μL时，凝胶电泳图中出现清晰扩增条带，荧光检测图中出现绿色荧光，当DNA模板浓度降至10 pg/μL时，有较暗条带产生，荧光检测图中也出现较浅的绿色荧光，所以该体系的灵敏度为10 pg/μL。

NC-阴性对照 1-1×104 pg·μL−1 2-1×103 pg·μL−1 3-100 pg·μL−1 4-50 pg·μL−1 5-25 pg·μL−1 6-10 pg·μL−1 7-1 pg·μL−1 M-Marker

3.4 真实样本检测结果

利用所建立的小檗皮VPCR荧光可视化检测体系对来自甘肃、青海、四川、云南、西藏的16个批次小檗皮药材进行真伪鉴定，鉴定结果如图6所示，除14号样本以外，其余15个样本在电泳图中均出现明显清晰的扩增条带，在荧光检测图中出现明显的绿色荧光。为验证检测结果的准确性，按照“2.2”项下操作利用ITS2通用引物对所有样本的基因组DNA进行扩增，并将得到的PCR产物进行测序，测序结果显示14号样本的ITS2序列与数据库中黄柏序列（MN966484.1）一致，判断14号样本为黄柏，其余扩增产物测序结果均与小檗皮序列一致。上述结果表明所建立的VPCR荧光可视化检测体系具有较高的准确性，可以应用于小檗皮药材的真伪鉴别。

NC-阴性对照 1～16-小檗皮待测样本 M-Marker

3.5 藏成药DNA质量评价

将“2.1”项下提取的藏成药DNA采用ITS2通用引物（S2F/S3R）进行PCR反应，检测藏成药的DNA质量。PCR产物凝胶电泳结果（图7）显示，这3种藏成药均在500 bp处有清晰明亮的扩增条带；荧光检测图中3种藏成药也均显示出明显的绿色荧光，说明本实验提取出的藏成药DNA均可以用于分子鉴别。

NC-阴性对照 1-BBJ 2-BBS 3-SWJH M-Marker

3.6 藏成药中小檗皮原料药的真伪鉴别

利用所建立的小檗皮VPCR荧光可视化检测体系对藏成药基因组DNA进行扩增和检测，检测结果如图8所示，3个样本在电泳图中均出现明显清晰的扩增条带，在荧光检测图中均出现明显的绿色荧光。上述结果表明，所建立的检测方法可以成功地检测出藏成药八味小檗皮胶囊、八味小檗皮散和四味姜黄汤散中的小檗皮原料药。

NC-阴性对照 1-BBJ 2-BBS 3-SWJH M-Marker

4 讨论

小檗皮品种多样，基原复杂，且资源有限，大宗中药材黄柏与小檗皮药材的外形均为黄色或鲜黄色，性状十分相似，所以药材市场上常出现以黄柏掺入小檗皮混用的情况，严重影响了药材的质量和临床疗效。药材的混用还会导致藏成药中原料药的混用，藏成药均为多味药制成，化学成分复杂，药材经过粉碎加工，其本身的性状已难以辨别，所以藏成药中原料药的真伪鉴定比原药材的真伪鉴定更加困难。本研究通过对小檗皮特异性DNA进行检测可以实现对小檗皮药材以及藏成药中原料药的真伪鉴别，研究结果显示该方法具有较高的特异性、准确性和灵敏度。值得一提的是，藏成药中的药材多以粉末形式入药，本研究使用的藏成药均不涉及提取物入药，所以可以轻松提取到足够量的DNA用于后续检测。如涉及以提取物形式入药的成药，药材DNA损失较大，还需要对其DNA提取和富集方式进行考察和优化，方能实现成药中原料药DNA的检测。

PCR技术是病原微生物检测、遗传疾病诊断、物种分类中最常用的检测技术之一，传统的PCR扩增方法需要在3个或2个特定的温度点保持一定的停留时间，整个操作需要60～70 min，本研究利用课题组自主研发的超快速VPCR技术对小檗皮特异性DNA进行扩增，扩增时间可缩短至30 min左右。由于本研究采用的PCR扩增仪配置较低，升降温速度较慢（平均升降温速率约为1.6 ℃/s），所以扩增时间较长，如采用升降温速率更快的PCR扩增仪，扩增时间可进一步降低至15～20 min。在扩增产物的检测方面，传统的凝胶电泳法耗费时间较长且操作繁琐，本研究利用SYBR Green I染料可与双链DNA结合发出绿色荧光的原理，实现了检测产物的可视化分析，使得检测结果更加直观，提高了检测效率。综上，本研究建立了小檗皮药材以及藏成药中小檗皮的快速可视化鉴别方法，对小檗皮的真伪鉴定提供了科学的技术手段，有利于药材及藏成药的质量控制和评价，同时本研究所用的方法为药材的分子鉴定提供了技术参考，也可以推广到其他品种的中药与民族药。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Identification ofand its Tibetan patent medicine based on Ultra-fast VPCR and fluorescence visual identification technology

LI Hong-ying1, SONG Wen-jun2, LI Hui-lin1, ZHANG Ji-chen3, FAN Gang2, CHEN Rong2

1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 3. Sichuan Tianfu New Area New Economic Development Research Center, Chengdu 610299, China

To develop an ultra-fast VPCR fluorescence visual identification method forXiaobopi ()-specific DNA to realize fast identification ofand its Tibetan patent medicine.Specific primers forwere designed according to the alignment results of theand its confusions. A fast VPCR amplification system was established for-specific DNA both in crude drugs and in Tibetan patent medicine. Moreover, this fast VPCR assay is also developed as a visual detection method by combing SYBR Green I fluorescent dye. Characters of an identification method including specificity, sensitivity, and generality were systematically studied.The amplification and fluorescence visual identification of-specific DNA could be finished within 40 minutes. The detection limit is as low as 10 pg/μL. A total of 16 batches ofwere analyzed by the developed method, of which 15 batches generated positive signals and one batch generated negative signal which was identified as Huangbo () using DNA sequencing method. All these results were 100% consistent with the sequencing results. Three kinds of Tibetan patent medicines containingwere analyzed and all samples yielded positive signals.The developed method not only greatly shortens the detection time, but also has a good specificity and sensitivity, which can effectively identifyand its Tibetan patent medicine.

; VPCR; fast amplification; visual detection; Tibetan patent medicine

R286.2

A

0253 - 2670(2023)12 - 3983 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.024

2022-12-09

国家自然科学基金资助项目（81874370）；国家自然科学基金资助项目（81973434）；四川省重点研发项目（2022YFS0434）；成都中医药大学“杏林学者”学科人才科研提升计划（QNXZ2018043）

李红颖，女，硕士研究生，研究方向为中药及民族药质量评价。E-mail: 1850631575@qq.com

通信作者：范 刚，男，博士，教授，研究方向为民族药质量控制及药效物质基础。E-mail: fangang1111@163.com

陈 蓉，女，博士，副教授，研究方向为中药及民族药分析及质量评价。E-mail: chenrong@cdutcm.edu.cn

[责任编辑 时圣明]