经颅磁声电刺激下皮层钙信号及突触传递特性的仿真与实验分析

赵清扬, 张帅, 杜文静, 徐亦豪

(河北工业大学 河北省生物电磁与神经工程重点实验室(筹),天津市生物电工与智能健康重点实验室, 天津 300130)

经颅磁声电刺激(transcranial magneto-acoustic-electrical stimulation, TMAES)作为一种新型的无创神经调控技术,具有较好的空间分辨率和刺激深度[1].TMAES通过磁场和声场2种物理场的耦合,共同作用于神经组织,在利用超声改变离子通道活性、降低神经元放电阈值的同时,通过磁声耦合产生的感应电流来调节神经组织的活动状态[2].经颅磁声耦合刺激方法率先由Stephen[3]提出,并在理论上诠释了该刺激方法的可行性.李慧雨等[4]通过实验证实声场与磁声耦合感应电场之间的高度一致性,进一步验证了TMAES对神经组织调控作用的可行性;袁毅等[5]基于Hodgkin-Huxley神经元模型,研究了TMAES对神经元放电模式的影响;Wang等[6]通过采集帕金森小鼠DG区的场兴奋性突触后电位,发现TMAES能够促进帕金森模型小鼠海马突触传递的长时程增强,揭示了TMAES可以通过调节突触传递可塑性进而改善帕金森小鼠的学习记忆能力;本课题组[7]通过采集大鼠执行T迷宫工作记忆任务中前额叶皮层的局部场电位信号,发现TMAES能够促进前额叶皮层神经元集群之间的信息交流与传递,进而改善大鼠的工作记忆.

突触传递可塑性在大脑皮层神经网络信息处理与传递过程中起重要的调节作用,其改变使生物体能够学习并形成记忆[8-9],其中,突触传递的短时程可塑性(short-term plasticity,STP)作为一种精确到毫秒到秒时间尺度的突触传递特性,其调节的皮层神经网络持续放电活动是维持工作记忆的重要原因[10-11].突触传递的短时程增强和抑制的产生都会影响多项目工作记忆的能力[12].Rolls等[13]表明突触传递的短时程增强增加了工作记忆的容量;Li等[14]研究了突触传递的STP对连续吸引子神经网络的影响,揭示了“动态扰动”通过STP原理改变了工作记忆项目的突触效率,并导致其相对记忆强度发生变化.大量研究表明,突触传递的短时程增强和抑制是突触前神经元钙积累的结果[15].突触传递效能可以通过残余钙的积累促进神经轴突末梢囊泡释放量而增加,或者通过囊泡耗竭而降低[16].最近研究显示,低强度低频超声可以通过激活星形细胞的TRPA1通道,打开钙离子通道促进谷氨酸的释放,从而引起突触传递效能的增加[17].刘亮等[18]提出,经颅超声刺激(transcranial ultrasound stimulation,TUS)可以通过调节谷氨酸等神经递质的释放影响突触间的信息传递,是多种神经退行性疾病缓解和治疗的潜在方法.

目前已发现TMAES对啮齿类动物工作记忆能力有明显的改善作用[7],但尚不清楚其如何调节突触传递进而影响工作记忆相关信息编码.为了探究TMAES对皮层钙信号及突触传递特性的影响,本文通过搭建基于磁声电效应改进的皮层锥体神经元模型,引入钙依赖神经递质释放的计算方法来计算TMAES不同磁场强度和超声功率强度引起的兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential,EPSP),随后以EPSP作为评价指标来评估不同TMAES参数下突触传递的STP.最后使用光纤光度检测实验验证TMAES对前额叶皮层神经元集群钙信号的调控作用,以揭示TMAES下钙依赖突触传递机制.该研究有助于进一步探究TMAES对工作记忆的深层调控机理,理解TMAES下工作记忆相关的皮层神经网络信息编码机制.

1 仿真模型

1.1 经颅磁声电刺激原理

经颅磁声电刺激对神经组织的调控机制主要包括磁声耦合效应和超声波机械效应.磁声耦合效应是指超声机械振动引起组织中带电粒子产生位移[2],在静磁场的作用下,带电粒子受到洛伦兹力的作用发生偏转,从而产生感应电流施加在神经元上[5].TMAES原理如图1所示.感应电流

图1 TMAES原理Fig.1 Principles of TMAES

(1)

其中,σ为组织电导率,B为磁场强度,W为超声功率强度,ρ为生物组织密度,c0为超声在组织中的传播速度.

超声波机械效应是指在磁声电刺激过程中,超声波机械振动引起细胞膜结构发生变化.在空泡动力学Rayleigh-Plesset方程的基础上求解修正的动力学压力平衡方程,得到单位面积膜电容Cm的近似推导[3]

Cm=Cm0+CAmpsin(2πft),

(2)

其中,Cm为膜电容,Cm0为静息状态膜电容,CAmp为在超声波刺激下神经元细胞膜电容变化量,f是超声频率.

1.2 基于磁声电效应改进的皮层锥体神经元模型

基于皮层锥体神经元模型进行了一系列改进,增加了磁声耦合刺激项和随超声频率变化的膜电容[19-20],并引入皮层锥体神经元钙浓度计算公式,以进一步计算钙依赖神经递质的释放[21].改进的皮层锥体神经元计算模型如下:

(3)

其中,V表示膜电位,INa、IK、ICa、IL分别为钠、钾、钙、漏电流,τc是钙浓度的衰减时间常数,C(Ca2+)是Ca2+浓度,C(Ca)是初始钙浓度,KCa为平均钙增益,是将钙电流转化为胞内钙浓度的参数.

(4)

其中,gNa、gK、gCa、gL分别表示Na+、K+、Ca2+和漏电流离子通道最大电导,其取值分别为20、20、40、2 ms/cm2,ENa、EK、ECa、EL分别表示Na+、K+、Ca2+、Cl-反转电位,分别为50、-100、120、-55 mV.m、h、n、w是相应的离子通道门控变量.各离子通道门控变量如下:

(5)

其中,β∞、γm分别为-1.2、18 mV,φw=0.15,τh、τn是时间常数,分别为15、80 ms.

1.3 EPSP计算方法

突触传递的生化过程如图2所示.刺激后,ICa内流引起局部钙浓度急剧上升,钙浓度的上升是诱导胞吐及神经递质释放的必要条件[9].研究表明:Munc18、SNARE蛋白、突触小泡蛋白、突触结合蛋白-1等突触前蛋白分子可以介导囊泡的融合和钙依赖性神经递质的释放[22-23].突触前钙依赖性囊泡释放概率P计算方程如下:

图2 突触传递生化过程Fig.2 Biochemical processes of synaptic transmission

(6)

其中,Pmax=1表示最大释放概率,希尔系数nH= 4,Kr,1/2是钙缓冲敏感度.

刺激期间可释放囊泡比率R的时间过程取决于释放位点恢复速率和胞吐率之间的差异.R随时间变化过程如下:

(7)

其中,k表示释放位点恢复速率,R反映了TMAES下突触前神经元囊泡实际释放情况.

谷氨酸(Glutamate, Glu)释放通量

FGlu=nNrPICa=nNRPICa,

(8)

其中,Nr是实际可释放囊泡数,由可释放囊泡比率R和可释放囊泡的总数N决定.

由于N在几秒钟的时间内大致保持不变.式(8)表明FGlu由2个关键变量R和P决定.初始状态时,假设所有囊泡首先被完全填充,则R=1.

EPSP的时间过程计算方法如式(9)所示.

(9)

其中,KGlu是单位Glu通量与α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid receptor, AMPAR)结合产生的EPSP增益,VE是EPSP幅值,τE是EPSP衰减时间常数,为40 ms.模型中各参数取值参考文献[20-21,24].

2 仿真结果及分析

2.1 不同TMAES磁场强度对STP的影响

EPSP反映了TMAES作用下突触后响应大小随时间的变化情况,而钙依赖的囊泡释放概率P和可利用囊泡比率R共同影响了EPSP的变化.为了探究TMAES不同磁场强度对突触传递过程及EPSP的影响,设置W为2.6 W/cm2不变,B分别为0.1、0.3、1 T时,皮层锥体神经元胞内钙浓度、R-P变化曲线、EPSP分别如图3～5所示.由图3可知,随着磁场强度B的增加,皮层锥体神经元钙浓度幅值和频率均明显提高.图4可知,P的变化趋势与TMAES作用下钙浓度变化趋势一致.随着P的增大,R产生衰减,当P达到最大时,R衰减到最小,随后P随着钙浓度的下降而减小,R上升.磁场强度B的增大引起钙浓度增加进而导致P上升,当P大于R时,产生囊泡耗竭现象.

P1、R1:B=0.1T,W=2.6 W/cm2;P2、R2:B=0.3T,W=2.6 W/cm2;P3、R3:B=1T,W=2.6 W/cm2图4 不同磁场强度下R/P变化曲线Fig.4 R/P curves at different magnetic field strengths

B=0.1 T时,如图4中P1与R1所示,P1远远小于R1,未产生囊泡耗竭,结合图5可以看出EPSP幅值持续增长未产生衰减;B=0.3 T时,如图4中P2与R2所示,P2在220 ms时大于R2,此时产生囊泡耗竭现象,结合图5可知EPSP幅值增长速率减缓;B=1 T时,如图4中P3与R3所示,P3在180 ms时大于R3,且P3与R3的差值持续增大,在约275 ms时达到最大,结合图5可知EPSP幅值在180 ms时增长速度减缓,在190 ms时产生幅度抑制.结果显示:随着TMAES磁场强度增大而产生的囊泡耗竭达到一定程度时,EPSP幅度才可以产生抑制现象.图5中,随着B的增加,EPSP最大幅值显著增大,但在不同的时间尺度上会产生幅度增长速率的减缓甚至抑制,这反映了突触作为信号过滤器的基本功能[15].超声功率不变的情况下,单独改变磁场强度可以通过调节钙依赖性囊泡释放进而影响EPSP,且当磁场强度较大时,EPSP幅度产生抑制,这种幅度抑制是由于TMAES较高磁场强度下高钙浓度引起的囊泡耗竭造成的.

图5 不同磁场强度下的EPSPFig.5 EPSP at different magnetic field strengths

2.2 不同TMAES超声功率强度对STP的影响

为了探究TMAES不同超声功率强度对突触传递过程及EPSP的影响,设置B为0.3 T不变,超声功率强度W分别为1.2、2.6、5 W/cm2时,皮层锥体神经元胞内钙浓度、R-P变化曲线、EPSP分别如图6～8所示.不同超声功率下皮层锥体神经元胞内钙浓度变化如图6所示.随着W的增加,胞内钙浓度幅值和频率均明显提高.不同超声功率下R-P变化曲线如图7所示.W=1.2 W/cm2时,参照图7中P4与R4,P4远远小于R4,未产生囊泡耗竭,结合图8可以看出,EPSP幅值持续增长未产生衰减;W=2.6 W/cm2时,P5在220 ms时大于R5,产生较小的囊泡耗竭,结合图8可看出,EPSP幅值在220 ms时增长速率减缓;W=5 W/cm2时,参照图7中P6与R6,P6在170 ms时大于R6,且P6与R6的差值持续增大,在约270 ms时达到最大,结合图8可以看出,EPSP幅值在170 ms时增长速度减缓,增长速率减缓对应的时间提前,但未产生幅度抑制,这是由于囊泡耗竭程度,即P与R的差值较小未达到产生抑制的条件.图8中,随着超声波功率强度的增大,EPSP最大幅值增加,W=2.6 W/cm2时,EPSP在220 ms时增长速度减缓,W=5 W/cm2时,EPSP幅值增长速率减缓的时间提前,但没有产生抑制.同样地,在磁场强度不变的情况下,单独改变超声功率可以通过调节钙依赖性囊泡释放进而影响EPSP.TMAES不同超声功率强度下高钙浓度产生的囊泡耗竭是造成EPSP幅度增长速率减缓甚至产生抑制的原因,只有囊泡耗竭程度较大时,EPSP幅度才会产生抑制.综上,TMAES对突触后响应大小的调节作用是双向的,磁场强度和超声功率的持续增大也会引起EPSP抑制产生.相关研究表明,用于维持神经网络的持续放电活动的突触传递的短时程增强和抑制是维持工作记忆的重要原因,而短时程增强减少了神经网络系统的固有漂移,从而延长记忆存储时间[11].因此,可以根据治疗需求,通过同时改变B和W来得到TMAES的对STP的最佳调控效果.

图6 不同超声功率强度下皮层锥体神经元胞内钙浓度随时间变化曲线Fig.6 Intracellular calcium concentration curve of cortical pyramidal neurons with different ultrasonic power intensity

P4、R4:W=1.2 W/cm2,B=0.3 T;P5、R5:W=2.4 W/cm2, B=0.3 T;P6、R6:W=5 W/cm2,B=0.3 T图7 不同超声功率强度下R/P变化曲线Fig.7 R/P curves at different ultrasonic power intensity

图8 不同超声功率强度下的EPSPFig.8 EPSP at different ultrasonic power intensity

3 实验验证及分析

为了验证TMAES能够通过调节皮层神经集群钙信号从而影响神经突触传递过程,本节使用光纤光度检测技术采集刺激前后小鼠前额叶皮层神经集群的钙信号,对其进行幅值、频率分析,从实验的角度探究TMAES对突触传递相关钙信号的影响.实验过程均遵循国际实验动物委员会和河北省实验动物管理办法的规定.

3.1 光纤光度检测实验

将15只KM小鼠(雄性,体质量(36±3) g,购于北京华阜康生物科技有限公司)随机分为3组,即假刺激组、TUS组和TMAES组.实验开始前使用体积分数4%的异氟烷对小鼠进行气体麻醉,随后将小鼠固定在与麻醉机相连的立体定位仪后,将异氟烷体积分数改为1%,待小鼠稳定麻醉后,分别在每只小鼠内侧前额叶皮质(ML:0.3 mm; AP:1.94 mm; DV:-1.6 mm)注入钙荧光蛋白rAAV-CaMKIIa-GCaMp6m-WPRE-hGH-polyA(武汉舒密脑科学技术有限公司),随后植入光纤.手术恢复14 d后,利用本课题组已搭建的磁声电刺激平台,使用超声功率强度为2.6 W/cm2的超声信号、磁场强度为0.3 T的永磁铁对TMAES组前额叶皮层进行刺激,TUS组开启超声,超声功率仍为2.6 W/cm2,去除磁铁,假刺激组不开启超声,去除磁铁.刺激过程持续120 s,使用光纤光度检测系统(南京千奥星科有限公司)对每只实验对象采集刺激前10 s和刺激后20 s内的钙信号数据.实验过程如图9所示.

a.TMAES及钙信号采集;b.TMAES刺激系统图9 TMAES与光纤光度检测实验Fig.9 TMAES and fiber optic photometric detection experiments

首先采用ΔF/F0作为钙信号幅度的相对变化指标,对不同刺激模式下前额叶皮层神经集群钙信号浓度的影响进行分析;随后对各组信号进行统计学分析,进一步验证TMAES对钙信号幅度影响的显著性;最后使用短时傅里叶变换对各组采集到的钙信号进行时频分析,探究TMAES对前额叶神经元集群钙信号代谢频率的影响.ΔF/F0的计算如下:

ΔF/F0=(Vsig-F0)/(F0-Voff),

(10)

其中,Vsig为实时记录到的钙信号,F0表示参考时间内钙信号的时间平均值,Voff表示当前分析钙信号通道的系统偏置数据,每次实验前需进行测定.

对钙信号的时频分析方法如下:

(11)

其中,X(ω)为钙信号的频率分布,ω是原始钙信号角频率,x(τ)是原始钙信号,t为信号时刻,gt,ω(τ-t)为对称的窗函数,窗函数采用步长为128的汉明窗.

3.2 实验结果

假刺激组、TUS组和TMAES组钙信号幅度相对变化量ΔF/F0随时间变化情况及钙瞬变信号热度图如图10所示,各组ΔF/F0如表2所示.图10a中ΔF/F0在刺激前10 s到刺激后20 s间,ΔF/F0在0上下不断振荡,刺激前后未产生明显的变化,图10b中ΔF/F0在TUS刺激后10 s显著上升,图10c中ΔF/F0在TMAES刺激后5 s显著上升.其中,黑色实线表示各组小鼠ΔF/F0的平均值,紫色部分为样本均值的标准差范围.结合热度图可以看出,假刺激组单个样本的ΔF/F0在刺激前后均未产生明显的上升或下降,TUS组和TMAES组单个样本的ΔF/F0在刺激后均明显提升,相比于TUS组,TMAES组钙信号幅度相对变化量的上升时间提前,增长幅度明显提高.将表2中3组数据的均值进行统计学分析,如图10d所示,可以发现,假刺激组、TUS组与TMAES组的ΔF/F0具有显著性差异(P<0.01).TMAES组平均ΔF/F0及标准差(2.406±2.457)明显大于假刺激组(0.205±0.987)和TUS组(0.762±1.767),均值差异反映了总体趋势,样本标准差的显著提高说明TMAES下钙信号幅度对均值的偏离程度更大,因此TMAES下钙信号幅度振荡的不确定性更高,TMAES可以显著提高前额叶皮层神经集群突触传递相关钙信号的浓度,且相比于TUS组调节效果更加明显.

表2 各组ΔF/F0值(x±s)

a.假刺激组;b.TUS组;c.TMAES组;d.统计学分析,***P<0.001图10 各组刺激前后钙信号幅度变化、热度图及统计学分析Fig.10 Analysis of calcium signal amplitude changes,thermogram and statistical analysis before and after stimulation in each group

图11a-c分别为假刺激组、TUS组和TMAES组刺激后400 s内钙信号频率的能量分布.假刺激组和TUS组钙信号频率主要集中分布于0～5 Hz,而TMAES钙信号频率主要分布于0～10 Hz,TMAES组分布于高频段的能量相对上升,这说明TMAES对前额叶皮层神经集群的钙信号代谢频率有一定的提升作用.动作电位的产生和突触囊泡的转运均依赖于电压门控钙通道的开闭以及细胞内钙离子复杂的代谢过程,因此TMAES可以通过调节前额叶皮层神经集群钙信号的代谢频率进而影响神经突触传递.

a.假刺激组;b.TUS组;c.TMAES组图11 刺激后各组钙信号时频分析Fig.11 Frequency analysis of calcium signal in each group after stimulation

4 结语

通过仿真与实验相结合的方法,分析TMAES对皮层神经元钙信号及突触传递特性的影响.首先通过搭建改进的皮层锥体神经元模型,引入钙依赖神经递质释放的计算方法以计算TMAES不同参数引起的EPSP,以EPSP作为评价指标来评估不同TMAES磁场强度和超声功率强度下突触传递的STP.随后使用光纤光度检测实验验证TMAES对前额叶皮层神经元集群突触传递相关钙信号的调控作用,以揭示TMAES下钙依赖突触传递机制.仿真结果发现,不同磁场强度和超声波功率强度均可影响EPSP,且TMAES对突触后响应的大小具有双向调节作用.TMAES不同磁场强度和超声强度均能提高胞内钙信号幅度和频率,其中,突触传递产生的短时程增强是由于TMAES下胞内钙浓度上升引起的囊泡释放概率的增加,而短时程抑制是由于TMAES较高的磁场强度和超声功率强度下胞内高钙浓度引起的囊泡耗竭造成的.实验结果表明,TMAES对前额叶皮层神经元集群钙信号幅度和频率均有明显的提高,TMAES可以通过调节神经钙浓度来影响突触传递.

计算了TMAES不同参数下细胞钙浓度、钙依赖囊泡释放及EPSP的变化情况,并探讨了TMAES下突触传递的生化过程,发现TMAES对STP具有双向调节作用,TMAES参数的增大可以在提高突触传递效能的同时,在不同时间尺度对突触传递效能产生抑制.因此,可以通过改变刺激参数来获得相应的突触传递效能的增强和抑制以达到治疗需求,从而实现对学习记忆的改善效果.此外,本文考虑到超声参数对动作电位的调节效果,对皮层锥体神经元模型进行了一系列改进,增加了磁声刺激项和随超声变化的膜电容,随后引入皮层锥体神经元钙浓度计算公式以计算由钙依赖神经递质释放引起的EPSP.但最近的一些研究表明,超声作为一种物理刺激,超声机械力对动作电位相关电压门控离子通道的激活、突触囊泡转运相关SNARE蛋白活性均具有积极作用[17,23,25].因此,未来应当将随超声声压变化的离子通道门控变量、TMAES对突触转运相关蛋白的影响纳入研究,更深入地了解TMAES细胞作用机制.本研究为进一步探究TMAES对工作记忆的调控机理、TMAES下工作记忆相关的皮层神经网络信息编码机制提供了理论支撑.