基于不同型号荧光定量PCR仪比对HBV DNA检测结果的一致性分析〔1〕

雷 艳,金郑宝,詹世淮,王佳伟,孙春萍,张胜行

(中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院,福建 福州 350000)

乙型肝炎(简称乙肝)病毒(HBV)感染仍然是世界范围内的公共卫生问题,目前HBV感染所致的肝硬化与肝癌是第十大死亡原因[1]。在过去的30年,得益于乙肝疫苗的接种,HBV表面抗原(HBsAg)的阳性率从1992年的约9.75%降至2014年的不到3.00%[2],然而基于中国人口众多,仍约有8 000万人HBsAg阳性。乙肝病毒DNA是病毒存在的直接依据,HBV DNA是病毒复制的标志。按照ISO15189《医学实验室质量和能力认可准则》要求,同一临床PCR实验室采用不同仪器进行同一项目的检测,应比对实验检验结果的一致性[3]。本文按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)EP9-A3的文件要求[3],对实验室ABI-7500和ABI-ViiA7 Dx定量PCR仪检测HBV DNA定量结果进行比对和偏移评估,评价其检测结果的一致性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

参加并通过国家卫生部室间质评的ABI-7500 PCR仪为参比仪器,ABI-ViiA7 Dx荧光定量PCR仪为实验仪器。其他仪器包括:H-100型恒温金属浴、Sigma1-16K高速冷冻离心机、湖南湘仪有限公司CTK80自动脱盖离心机、北京东联哈尔仪器制造有限公司CLASS Ⅱ TYPE B2生物安全柜。

1.1.2 试剂

中山大学达安基因诊断公司提供的HBV DNA核酸定量检测试剂(批号为2021013);标准品、阴性对照品、阳性对照品试剂盒自带;广州邦德盛生物技术有限公司生产的乙型肝炎病毒DNA低值S2和中值S4标准质控品(批号为:2021001)。

1.1.3 标本来源

收集本院2021年4月份门诊和住院患者中无溶血、脂血、黄疸的新鲜血浆样本,选取40份ABI-7500荧光定量PCR仪检测过的HBV DNA阳性血浆样本分装于1.5 mL EP管中,放于-20 ℃冰箱备用。HBV DNA浓度分布覆盖整个线性范围(102～108IU/mL)。

1.2 方法

1.2.1 HBV DNA核酸提取与扩增

1.5 mL EP管中加入450 L DNA提取液,4 μL内标和200 μL经3 500 r/min离心5 min后的临床乙肝血浆样本,振荡混匀后置于100 ℃金属浴10 min,12 000 r/min高速离心5 min,DNA上清备用。每次检测均加入乙肝标准品(浓度2×103～2×106IU/mL)、阴性质控品、空白以及邦德盛公司的强阳性和弱阳性质控品。缓慢吸取离心过的20 μL DNA上清液加入反应管中,瞬时离心后放入PCR Ⅲ区的荧光定量PCR仪上扩增。

1.2.2 比对方法

按照NCCLS EP9-A3的文件建议,每天检测10份样本,连续检测4 d,每份样本均进行双孔平行测定。扩增结束后将两次测定结果转化为10的对数,取其平均值进行仪器间的比对分析。通过计算线性回归方程、显著性分析和相对偏倚进行HBV DNA结果比对。

1.3 统计学方法

1.3.1 离群值检验

按NCCLS EP9-A3文件进行离群值检验,将所有检测结果进行对数转化,以40份血浆样本在两台仪器上测定差值的平均值的4倍作为离群值的判断限,所有差值都在判断限内则无离群值。

1.3.2 两台仪器结果一致性分析

设定ABI-7500 PCR仪测定的浓度对数值为X值,在ABI-ViiA7 Dx上测定的浓度对数值为Y值,计算线性回归方程:YABI-ViiA7Dx=aXABI-7500+b,并采用配对t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

1.3.3 计算不同仪器的相对偏倚

将两台仪器两次重复测定HBV DNA结果转化为10的对数,分别计算两台仪器上检测结果的平均值,相对偏倚(%)=(ABI-ViiA7 Dx检测结果均值-ABI-7500检测结果均值)/ABI-7500检测结果均值×100%,相对偏倚<±7.5%则在临床检测结果可接受范围内[4]。

2 结 果

2.1 离群值检验

ABI-7500差值的平均值为X′=0.123 6,ABI-ViiA7 Dx差值的平均值为Y′=0.186 5,离群值判断限为0.494 4和0.746 0,结果表明两台仪器检测HBV DNA的定量值均无离群(见图1)。

图1 40份临床标本浓度离群值

2.2 两台仪器间结果比较

对两台仪器测定的40份临床样本的HBV DNA定量结果配对t检验分析可知P=0.256,P>0.05,差异无统计学意义,表明ABI-7500与ABI-ViiA7测定HBV DNA定量结果具有良好的一致性,符合临床检测的需要。

2.3 两台仪器结果一致性的比较

以ABI-7500检测结果的对数值为X轴,以ABI-ViiA7 Dx检测结果的对数值为Y轴,两仪器检测结果的线性回归方程为YViiA7=0.998X7500+0.039 2(见图2),r2=0.9919,r2>0.980,表明ABI-7500与ABI-ViiA7 Dx检测HBV DNA的结果具有良好的相关性。

图2 ABI-7500与ABI-ViiA7测定HBV DNA结果的一致性

2.4 计算相对偏倚

在两台定量PCR仪上测定的40份血浆样本HBV DNA,相对偏倚均<±7.5%,符合ISO15189对临床基因扩增检验实验室内检测系统比对的标准要求,表明两台仪器均能用于HBV DNA定量检测。

3 讨 论

PCR技术自1985年由Kary Mullis开发以来,其在核酸检测系统中的应用彻底改变了DNA和RNA的定量分析。荧光定量PCR法检测HBV能够衡量患者体内病毒DNA复制的活跃度及病毒载量的高低[4]。HBV DNA定量与肝炎病毒感染机体后疾病的进程密切相关,能反映患者体内乙肝病毒的复制水平。HBV DNA阳性是患者具有传染性的标志,DNA测定对乙肝两对半起补充作用,还能判断肝功能异常是否由病毒引起[5],可评价抗病毒药物的疗效以及判定预后。临床上将经干扰素或拉咪呋啶治疗后HBV DNA值小于103copies/mL作为阴性或临床治愈的标准[6]。HBV DNA可检出隐匿性慢性乙型肝炎,对乙肝病毒的防治具有重要作用。在HBV DNA的定量检测过程中,不同型号PCR仪的光路系统或温度模块具有差异,HBV DNA在不同仪器上的定量值会有一定的偏差。随着新的实时荧光定量PCR(qPCR)试剂盒的增加,HBV DNA定量一直在不断发展。Lall等[7]通过线性回归的散点图、精密度、灵敏度及最低检测线等方面对不同定量试剂进行性能验证。本研究表明两台不同型号的荧光定量PCR仪测定40份临床血浆样本均无离群值出现;线性回归方程结果显示r2=0.991 9,r2>0.980,表明两台仪器HBV DNA定量结果具有良好的相关性;两仪器HBV DNA定量结果的相对偏倚均<±7.5%,检测结果具有良好的一致性。

综上所述,ABI-7500和ABI-ViiA7 Dx可同时用于临床HBV DNA定量检测。