无刺1号刺梨快繁体系的建立

吴辉晶,安华明,2,鲁 敏,2

(1 贵州大学农学院,贵阳,550025;2 贵州省果树工程技术研究中心,贵阳,550025)

无刺1号(Rosaroxburghiif.eseiosaKu)是蔷薇科蔷薇属植物,是刺梨(R.roxburghii)的变型[1-2],本实验室无刺1号是在贵州省黔西县所采集的无刺刺梨资源[3-4],果实和叶片均具有较高的抗氧化能力[5-6],每100 g鲜果中维生素C含量为1 977.34 mg[7];因其果皮表面无肉眼可见的针状刺,与其他刺梨品种有明显的外观差别,但通过扫描电镜观察发现[8-9],无刺1号的果皮表面存在不同形态的表皮毛。目前已开发出无刺1号的特异分子标记,可快速鉴别无刺1号及其后代中的无刺单株,进而能缩短育种周期[10]。

无刺1号因果皮无刺,可作为重要的鲜食刺梨资源进一步选育大果种质,同时也可适量推广种植,有利于解决目前刺梨果实仅用作加工且品种单一的问题。刺梨目前较为常见的繁育方式为扦插繁殖,其繁殖速度相对较慢。利用植物组织培养技术建立无刺刺梨快繁体系,既可保持母本的优良性状,也可提高繁殖效率,有利于种质资源的保存[11]和优质种苗繁育。本研究以无刺1号的带腋芽茎段为材料,研究了其腋芽诱导、增殖、生根培养、驯化移栽的情况,建立了无刺1号的离体快繁体系,加速种苗繁育进程,从而促进刺梨产业发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料来自贵州省贵阳市贵州大学刺梨种质资源圃,取其当年生营养枝,带回实验室备用。

1.2 试验设计与试验方法

1.2.1 外植体的消毒 4—9月于晴天采集生长健壮、无病虫害无刺1号当年生营养枝为外植体,将采集的营养枝首先用流水快速冲洗10 min,再用洗洁精浸泡30 min,期间间断晃动。用自来水冲洗干净,无菌水漂洗3次置于广口瓶中存放。然后在无菌操作台用75%酒精进行浸泡(15、30 s),再用升汞消毒(8、10、12 min),消毒时不断摇动。消毒后用无菌水清洗4～6次,将茎段用无菌滤纸吸干表面水分,并剪去两端褐化部分,单芽放入培养基中诱导。

1.2.2 诱导培养 用MS作为基本培养基,蔗糖浓度为30 g/L、琼脂浓度为6 g/L,pH值为 5.8。采用正交实验的方法,对生长素NAA(0.1、0.2 mg/L)和细胞分裂素6-BA(0.5、1、1.5 、2.0、2.5、3.0 mg/L)浓度进行筛选,将处理好的带芽茎段接入培养基中,试验共设9个处理,每个处理15瓶,每瓶放置外植体4枚,每个处理重复3次,培养40 d后统计萌发率。

1.2.3 增殖培养 将萌发适宜大小的腋芽从基部切掉,与外植体分离,去掉老化的组织后接种到增殖培养基上。增殖培养基以MS为基本培养基,添加不同浓度的6-BA 和NAA。每个处理接种15瓶,每瓶接种4个苗,每处理重复3次。每天观察其生长情况,28 d后统计增殖系数及再生芽生长状况。培养中获得的健壮芽苗进行培养。

1.2.4 生根培养 取株高1.5 cm 的植株进行生根诱导,以1/2 MS为基本培养基,蔗糖浓度20 g/L,分别添加不同浓度的IBA和活性炭。每个处理接种15瓶,每瓶中接种2个苗,每处理重复3次。40 d后观察每个处理的生根情况,统计生根率,平均每株根条数。

1.2.5 移栽炼苗 将生根良好、生长健壮的无刺1号组培瓶苗从组织培养室中移至普通实验室或温室大棚内,将瓶盖揭开1/3的开度,放置2 d,小心从培养基中取出根部,用无菌水冲洗3～4次。然后用多菌灵浸泡1 h后,移入灭菌蛭石中,在塑料杯子上下覆盖30 d后,将植株从塑料杯子中移栽至蛭石∶腐殖土∶珍珠岩= 1∶1 ∶1 的基质中,并用小拱棚覆盖,进行炼苗。炼苗过程中,保证基质有足够的水分,并采取一定的遮光措施,结果其成活率达(87.74±12.43)%,长势良好。炼苗结果见图1。

注:A、B为炼苗1个月后的生长情况;C 为炼苗6个月后的生长情况。

1.3 数据处理及分析

污染率/%=污染的外植体数/接种外植体数×100。

萌芽率/%=腋芽萌发的外植体数/接种外植体数×100。

褐化死亡率/%=腋芽不萌发及褐化的外植体数/接种外植体数×100。

增殖系数=有效芽数/接种芽数(有效芽为高度大于1 cm 的芽)。

生根率/%=生根苗数/接种苗数×100。

平均每株根条数=生根植株的总根数/生根植株数。

移栽成活率/%=成活苗数/移栽苗数×100。

采用IBM SPSS Statistics 26软件进行统计分析,用邓肯氏新复极差法进行差异显著性检验(α=0.05),用Word 2020、 Exce1 2013制作图表。

2 结果与分析

2.1 取材时期对外植体污染率的影响

不同取材时间对污染率的影响见图2,4—9月,外植体的污染率逐月增加。4月接种,污染率最低,仅为7.71%;5月和6月分别增至12.15%和19.46%;7月污染率急剧上升为4月的4.27倍;7—9月污染率继续上升,9月污染率达最高,为46.81%,是4月的6.24倍。外植体基部与培养基接触部分生出黑色毛状霉菌,极易扩散。所以,无刺1号刺梨茎段组培快繁的最佳取材时期是4—5月春季生长期。

注:图中不同小写字母表示处理间差异显著(p<0.05)。

2.2 消毒方法对外植体污染率、褐化死亡率及萌发率的影响

污染率、褐化死亡率及萌发率是植物组织培养体系的建立的基础。不同消毒方法对无刺1号外植体污染率、褐化死亡率及萌发率的影响见表1,当酒精消毒时间一定时,外植体污染率和萌发率随着升汞消毒时间的增加基本呈下降趋势,显著性大体上逐渐降低;随着0.1% HgCl2处理时间的延长,外植体的污染率呈现逐渐降低的趋势,但与此同时,由HgCl2自身引起的外植体褐化程度也逐渐加剧,当处理时间为8 min时,除去褐化死亡及污染的影响,外植体萌发率达到所有处理中最高值,为88.14%,但其污染率较高。外植体消毒灭菌的方法除萌发率外,还需考虑污染率及褐化死亡率两个指标的表现。综合上述3个指标,筛选出最适宜无刺1号外植体消毒灭菌的方法为:先用75%酒精消毒30 s,无菌水冲洗3～4次,然后用0.1% HgCl2消毒10 min,无菌水冲洗5～6次。

表1 不同消毒方法对无刺1号外植体污染率、褐化死亡率及萌发率的影响

2.3 植物生长调节剂组合对茎段腋芽诱导的影响

无刺1号茎段培养9 d后腋芽开始萌发,基部切口变膨大,不同植物生长调节剂组合对无刺1号茎段萌发的影响见表2。不同植物生长调节剂浓度配比对无刺1号初代诱导培养的各处理间差异显著,无刺1号的腋芽诱导率随6-BA浓度的增加,在NAA浓度为0.1 mg/L 时,呈现为“低—高—低”,在NAA浓度为0.2 mg/L时,逐渐降低。当6-BA浓度一定时,随NAA浓度的升高,6-BA的浓度为 2 mg/L时,诱导率呈现为逐步升高,当6-BA浓度升至3 mg/L时,诱导率在逐渐降低;当6-BA的浓度为2.5 mg/L、NAA 的浓度为0.1 mg/L时 ,腋芽诱导率达到最高90.63%。

表2 不同植物生长调节剂组合对腋芽诱导的影响

2.4 植物生长调节剂组合对不定芽增殖的影响

不同植物生长调节剂组合对不定芽增殖的影响见表3。无刺1号在腋芽处诱导出不定芽,增殖现象普遍出现在腋芽处,随着6-BA浓度增加,诱导出的不定芽数量也随之增多,其增殖系数明显提高。但当6-BA浓度增至3 mg/L时,生长受阻,诱导出的不定芽开始减少,出现叶片黄化的现象。NAA浓度增高对增殖有一定的抑制作用,随着其浓度上升愈伤组织不断增多,而不定芽分化率降低,且出现较严重的叶黄化现象。当NAA浓度为0.1 mg/L时,增殖系数随6-BA浓度的增加而增大;当NAA浓度为0.2 mg/L时,增殖系数也随6-BA浓度的增加而增大,但小于NAA浓度为0.1 mg/L时的增殖系数。因此,无刺1号最佳增殖培养的植物生长调节剂组合为MS + 1.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA。

表3 不同植物生长调节剂组合对无刺1号不定芽增殖的影响

2.5 植物生长调节剂组合对诱导生根的影响

取生长优良的无菌苗进行生根培养,生长过程见图3。不同植物生长调节剂组合对诱导生根的影响见表4。在无任何植物植物生长调节剂的1/2 MS培养基上,也能长出根,但是自然生根率和平均单株根数均低。在培养基添加生长素IBA或活性炭,组培苗生根率、平均单株根数均显著提高。IBA在低浓度下,植株的根数较少,当IBA质量浓度升高至0.3 mg/L时,生根率达到最高,浓度继续增加,生根率不再增长,反而略有下降。在加入适量活性炭后,对植株的生根率也有所提高。处理4与各处理间的生根率存在显著差异,为87.30%,平均根数为2.74。综上,无刺1号刺梨最佳生根培养基为1/2 MS+IBA 0.3 mg/L+活性炭 0.5 mg/L,生根效果良好。

表4 不同植物生长调节剂组合对无刺1号诱导生根的影响

注:A. 茎段的芽诱导;B.增殖培养;C.生根培养。

3 讨论与结论

外植体的污染问题对快繁体系的建立具有重要的影响,污染的控制主要存在在3个方面:外植体、培养基和人工操作[12]。其中外植体的污染是最复杂难控的,与取材的时间、部位等有极大的关系。本研究发现4—5月取样,污染率较低,且显著低于7—9月;此外,在刺槐[13]、豫楸[14]、蓝莓[15]等植物的研究中表明外植体取材时期最佳均在4—5月,与本研究结果一致。前人研究表明,4—5月是新枝的旺盛期,时间较短,接触的灰尘、细菌等较少,且春季温度偏凉爽,细菌滋生较少[16-17]。在无刺1号组织培养的实验中污染率与植物的生长发育时期及外界环境有关,除取样时间外,消毒方法对污染率也存在一定影响,周成城等[18]研究表明,酒精和升汞配合使用对外植体消毒效果更佳。本研究结果表明以无刺1号茎段为外植体的最佳消毒浓度及时间为75%酒精和1%升汞消毒30 s。其升汞消毒时间不宜过长,否则会影响腋芽的萌发、增大褐化死亡的数量,这与鲁艺[19]、李瑞静[20]、胡计红[21]等研究结果基本一致。

初代培养中,本研究使用1 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA的2种浓度组合下的无刺1号萌发率低、腋芽萌发晚。有研究表明[22-24],添加KT、GA3后的茎段萌发有所提高,但笔者添加后萌发率仍然很低,且基部愈伤较大,萌发时间较长。在此基础上,增大6-BA浓度至2.5 mg/L,其诱导率提高至90.63%,诱导率大幅提高且生长状态良好,这与武荣华[25]、刘文竹[26]、梁峥[27]等研究结果一致。

在增殖培养阶段,植物生长调节剂浓度范围过高或过低都会影响外植体的生长。6-BA、NAA组合能有效促进丛生芽形成,最高增殖系数为3.94。这一结果与不同品种刺梨的研究结果存在一定差异:王小平[28]培养刺梨的最高增殖系数为4.2,廖安红[29]培养“贵农5号”的最高增殖系数为2.58,李斌等[30]培养无籽刺梨的最高增殖系数为5.56。由此可知,适合不同刺梨及近缘种材料的最佳植物生长调节剂浓度组合是不同的,基因型之间的组织培养效果差异明显。

在生根培养阶段,前人研究表明无机离子减半有利于生根[31]。因此,本试验以1/2 MS 为基本培养基,添加不同浓度的IBA 展开试验,在未添加任何植物生长调节剂的1/2MS培养基上,其生根率较低,而在添加相应植物生长调节剂的1/2MS生根培养基上,生根率随植物生长调节剂的增加而升高。本实验中,以1/2 MS+IBA 0.3 mg/L的培养基生根效果最好,该结果与月季“雪山”[32]、无籽刺梨[33]等的实验结果一致。此外,本试验还发现IBA在 0～0. 4 mg/L 浓度范围内,随着浓度的增加,生根率和生根数均呈上升趋势。因此,本研究认为在生根培养过程中应加入适量植物生长调节剂以增加其生根率与生根数,但浓度不宜过高。