山东地区鸡沙门氏菌耐药性分析

吕俊峰 董文宇 李琦 陈书民 陶庆树 曹兵 田野

摘 要：沙门氏菌是一种寄生在人和动物小肠内的革兰氏阴性直杆菌，可引起急性或慢性人兽共患传染病。本试验通过对山东地区7个地级市共69个养鸡场进行随机采样，利用PCR扩增沙门氏菌目的基因和血清凝集试验的方法对沙门氏菌进行鉴定。结果显示，从山东省各地级市养鸡场采集的2050份样品中共检测出沙门氏菌阳性样品18份，分离菌鉴定均为鸡白痢沙门氏菌，并对阳性菌株进行培养纯化，利用K-B纸片法检测沙门氏菌对氨苄西林、西诺沙星、磺胺异噁唑等11种药物的敏感性。本研究可供山东地区养殖场参考，对沙门氏菌的防控和治疗具有重大意义。

关键词：沙门氏菌；PCR；血清学检测；药敏试验

沙门氏菌是一种寄生在人和动物小肠内的革兰氏阴性肠直杆菌，血清型超过2 500种，无芽孢和荚膜，兼性厌氧，其生长对培养基要求不高，普通营养型琼脂培养基就可以生长[1]，菌落为圆形淡黄色的小菌落，表面稍微隆起、湿润、光滑半透明、边缘生长整齐，易于识别；多数单个存在，少数呈两个或多个黏连在一起。在SS琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基上，菌落呈现无色透明的形态，若和硫化氢接触则呈现为中心黑色的菌落[2]。沙门氏菌感染严重危害着畜禽养殖业和人类的公共卫生安全。

1 材料与方法

1.1 样品来源和阳性菌株

样品来源于山东省临沂、济宁等七个地级市的69个家禽养殖场，采集肝、脾、肾等脏器和鸡血液，阳性菌株由山东省农业科学院家禽研究所禽病研究室分离保存，并标记备用。

1.2 试剂耗材

RNA提取试剂盒，购自杭州Axygen科技有限公司；PCR试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；鸡白痢染色平板凝集试验抗原，购自北京擎科生物科技有限公司；抗生素药敏纸片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 取待检鸡的肝、脾、肾等内臟器官，无菌采取各脏器5～10 g。将所取组织器官放入匀浆杯内按一定比例加入PBS缓冲液（pH 7.2）研磨。待匀浆杯内的组织器官完全打碎和PBS混匀后，将匀浆杯内的液体倒入1.5 mL离心管，8 000 rpm离心5 min取上清300 μL。放入-80℃冰箱内反复冻融2次备用。

1.3.2 细菌的分离 将接种环在酒精灯上烧至变红，待冷却后插入肝脏旋动几周，在TSA血清培养基上划线，37℃恒温培养24 h。挑取单一菌落在TSA培养基上划线进行纯化培养，37℃恒温培养24 h备用。

1.3.3 细菌的鉴定

1.3.3.1 革兰氏染色鉴定 用接种环挑取经过纯化培养的单一菌落，涂抹到滴加有5 μL生理盐水的载玻片上，混匀后涂抹均匀，滴加结晶紫染色液染色2 min，冲洗干净；碘液染色1 min，冲洗干净；95%酒精脱色30 s，冲洗干净；番红复染2 min，冲洗干净；然后用吸水纸将多余的水分吸干，干燥10 min，在油镜下观察。

1.3.3.2 PCR扩增 将分离纯化培养的菌株用10 μL的枪头挑取单菌落，稀释于装有10 μL ddH20的离心管中混合均匀，离心后的上清作为模板进行PCR扩增，向离心管中加入鸡白痢沙门氏菌鉴别PCR引物（表1）。

上述引物由上海生工生物工程有限公司合成。按照设计好的鸡白痢沙门氏菌25 μL反应体系加入各组分（表2）。

将配备好体系的待鉴定样品按照设计好的鸡白痢沙门氏菌PCR反应体系对目的基因进行扩增。PCR反应条件见表3。

扩增后的反应产物经1%琼脂糖凝胶检测，出现条带的PCR产物送至擎科生物科技有限公司测序。

1.3.3.3 细菌血清学鉴定 玻片凝集试验：取洁净玻片一张，分为3格并标号，无菌环境下将鸡白痢染色抗原震荡均匀，吸取30 μL鸡白痢染色抗原垂直滴加至各个格子上。在第1个格子滴加鸡白痢标准阳性血清30 μL，第2个格子滴加阴性血清30 μL，第3个格子滴加待鉴定样品30 μL，吸取待鉴定鸡血液50 μL滴加在抗原液滴上，将待鉴定鸡的血液与抗原混匀并摊开直径约2 cm左右的薄层，轻轻晃动玻片，2 min后观测结果并记录。判定标准为：鸡白痢沙门氏菌染色抗原和血清混合后2 min内出现颗粒状沉淀为阳性，圆滑的水滴状或均匀分布无沉淀为阴性。

高通量血清学鉴定沙门氏菌：吸取研磨离心后的病料祥本30 μL于鸡白痢血凝抑制平板上，吸取鸡白痢多价染色平板凝集试验抗原30 μL滴在样本液滴上，2 min后观察结果。若呈现出蓝色的颗粒状沉淀则为阳性；若仍为均匀的水滴状或乳状无沉淀则为阴性。阳性样本应进行复测，以排除病料组织小碎渣或假阳性的干扰。

1.3.4 细菌的耐药性检测

1.3.4.1 细菌的培养 用10 μL枪头挑取分离纯化培养的单一菌落放在LB液体培养基中，混合均匀，将培养基放入振荡培养箱中，在37℃、200 r/min的条件下培养12 h备用。

1.3.4.2 涂板和药敏片的贴置 吸取培养后的LB液体培养基200 μL，放入LB固体培养基上涂抹均匀，用无菌镊子夹取药敏片贴在培养备用的培养基上，每个药敏片间距≥15 mm，轻轻按压防止脱落，每个平板贴4～5片。药敏片贴置情况如表4所示。贴好后在恒温培养箱37℃培养24 h。将达到时间的培养基放在深色背景下，用游标卡尺测量各种药敏片抑菌圈的直径，并同美国FDA认证的标准（表5）进行比较。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离和鉴定

在普通营养琼脂上肉眼观察沙门氏菌菌落的形态：菌落的表面光滑，边缘整齐，表面有稍微的隆起，颜色半透明。如图1所示。

上述分离菌经过革兰氏染色、显微镜下观察，视野中呈现出单一、形态均匀、两端平滑钝圆的短杆状粉红色小杆菌，初步判断为沙门氏菌。如图2所示。

用10 μL枪头挑取疑似沙门氏菌的样本，利用PCR扩增目的基因，通过琼脂糖浆电泳成像系统观察到目的条带大小约为200 bp（图3）。本试验通过PCR扩增鉴定的2 050份样本中，共检测并分离出18株鸡白痢沙门氏菌菌株。

2.2 测序结果

将分离的18株沙门氏菌进行测序，结果见图4。

从检测报告分析结果可以看出，测序检测片段覆盖率为94%，样本同源性100%符合鸡白痢沙门氏菌基因序列。

2.3 血清学鉴定结果

试验对2 050份样本进行高通量的血清学试验，检测结果有18份阳性血清，阳性占比为0.87%，血清型全为鸡白痢沙门氏菌。高通量血清学鉴定结果示例具体情况如图5鸡白痢沙门氏菌血清学试验所示。

2.4 样品检测结果

从山东省临沂市、泰安市、日照市、济宁市等7个地级市的69个养殖场共采集的2 050份样本中共分离出18株鸡白痢沙门氏菌。阳性数和阳性率结果如表6所示。

2.5 沙门氏菌药物敏感性试验结果

选取1株感染率最高的沙门氏菌进行药敏试验。通过测量不同种药物抑菌圈的直径大小来判定沙门氏菌对药物的敏感程度。将测出的抑菌圈大小和美国FDA临床微生物实验室2017年发布的耐药性标准进行比对，判定结果如表7所示。

3 讨论与结论

沙门氏菌是一种寄生在人和动物小肠内的革兰氏阴性肠直杆菌，在自然界随处可见，是引起人兽共患传染病的重要细菌。沙门氏菌感染在临床上多表现为败血症、肠炎、腹泻等，以生殖系统感染为主，公鸡表现为睾丸炎，母鸡表现为卵泡变形、输卵管堵塞伴发炎症等，导致产蛋量减少、产蛋率降低、蛋受精率降低、孵化率和健康育雏率下降[3]，严重时可引起公鸡睾丸极度萎缩，母鸡卵巢破裂，导致死亡[4]。鸡白痢沙门氏菌病可进行水平传播和垂直传播。目前在我国，鸡白痢沙门氏菌病仍然对养禽业的发展有着巨大的危害。

本研究对山东地区7个地级市（济南、德州、日照、临沂、泰安、济宁、东营）共69个大小家禽养殖场的2 050份样品进行分离鉴定，得到18株鸡源性沙门氏菌，分离率为0.87%，分离出的18株鸡源性沙门氏菌经鉴定为鸡白痢沙门氏菌。

用K-B纸片法对分离出的沙门氏菌进行11种药物敏感性试验，结果显示沙门氏菌对这11种药物有不同程度的敏感性，对阿米卡星、头孢噻污、头孢他啶、氟苯尼考、茶啶酸为低敏感度，对强力霉素、左氟沙星、庆大霉素、多粘菌素、磺胺异噁唑、氨苄西林为高敏感度。赵建梅等[5]和李雪等[6]对沙门氏菌耐药性的结果研究分析发现，不同地区沙门氏菌对药物的敏感程度存在差异，且沙门氏菌对不同药物均存在一定的耐药性。因此，加强对畜禽养殖过程中抗生素使用的管控，在对沙门氏菌的治疗中建议采用氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类药物进行治疗。

参考文献：

[1] 查华. 华东地区鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定、分子流行病学及致病性研究[D].扬州：扬州大学，2013.

[2] 许文婷.牛沙门氏菌病的病原学及综合防治[J].养殖与饲料，2022，21（02）： 81-82.

[3] 吉尚雷，劉欣，刘立英，等.肉鸡源沙门氏菌的分离鉴定及耐药性分析[J]. 现代畜牧兽医，2021（06）：72-74.

[4] 谢宝年.鸡白痢的危害与防控措施[J].养殖技术顾问，2011（09）：2-3..

[5] 赵建梅，李月华，张青青. 2008～2017年我国部分地区禽源沙门氏菌流行状况及耐药分析[J].中国动物检疫，2019，36（08）：27-35.

[6] 李雪，孙坚，廖晓萍.山东地区禽源沙门氏菌的耐药基因流行性调查及分析[J].中国家禽，2015，37（18）：63-65.

Abstract：   Salmonella is a Gram-negative Enterobacter parasitic in the small intestine of humans and animals， which can cause acute or chronic zoonotic infectious diseases. In this experiment， chickens from 69 farms in 7 prefecture-level cities in Shandong were randomly sampled，and Salmonella was identified by PCR amplification of 16S rRNA gene and serum agglutination test. The results showed that 18 salmonella positive samples were isolated from 2 050 samples collected from farms in various prefecture-level cities in Shandong Province. All of them were identified as Salmonella pullorum.The purpose of this experiment is to observe the electrophoresis image of agar syrup by PCR test， and to culture and purify the positive strains.The sensitivity of Salmonella to 11 drugs such as ampicillin， cinoxacin and sulfaisoxazole is detected by K-B paper method. This study can be used as a reference for large and small farms in Shandong，and it is of great significance for the prevention， control and treatment of salmonella.

Keywords： Salmonella；PCR；Serological detection；Drug sensitivity test