鸽源沙门氏杆菌的分离鉴定与药敏性

赵 宇,邓梦青,卢昱希,唐远江,张 涛,陶小艳,李 婷,张晓可,文正常,潘 永,王 璇

(贵州省畜牧兽医研究所,贵州 贵阳 550005)

0 引言

【研究意义】沙门氏菌(Salmonella)是一种人兽共患病原菌,是肉鸽养殖业中流行面和传染性最广、危害性极大的常见流行性传染病[1],加之目前病原菌耐药性的提升,寻求有效防治沙门氏菌病的抗生素替代品迫在眉睫。【前人研究进展】沙门氏菌主要传播途径为粪-口途径以及通过食入被污染饲料和水源传播,也可通过胚胎使种蛋受感染进而传递给后代。此病原易侵染1月龄内幼鸽[2],被感染肉鸽表现多为急性下痢,粪便呈石灰浆样白色稀薄或呈青绿色,并发出恶臭,部分病例可能出现关节变形肿大以及神经症状等[3]。成年鸽感染后食欲减退、精神沉郁、机体消瘦,其产蛋量、孵化率等生产性能严重下降,给肉鸽养殖业造成极大经济损失[4-5]。临床致病性沙门氏菌易产生耐药性且不易控制,在养殖过程中由于抗生素的反复不合理使用导致病原菌耐药性快速提升,抗生素滥用也易造成禽类产品的药物残留,不仅增加了该病的防治压力,也给人类健康带来威胁[6-8]。中草药具备作为减抗替抗产品的天然优势,不但具有广谱的抑菌作用、降低细菌耐药性形成,同时还有促进畜禽生长、提高免疫等功能,是耐药病原菌防控的新途径[9]。【研究切入点】目前,中草药对沙门氏菌的抑制作用研究较普遍,其中,对猪源沙门氏菌与鸡源沙门氏菌的研究较为集中,而在鸽沙门氏菌的研究相对较少。【拟解决关键问题】通过分离鉴定临床鸽源沙门氏菌,探讨分离菌对常见抗生素及自拟复方中药的敏感性,以期为肉鸽养殖场沙门氏菌合理用药及中兽药防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采于西南地区某肉鸽养殖场10日龄发病乳鸽病死后肠内容物及粪便。沙门氏菌标准菌株由西南大学动物医学院生理生化实验室保存提供。

1.1.2 主要药品与试剂 抗菌药物药敏纸片、细菌生化鉴定管、革兰氏染色液及各类细菌培养基均购于杭州微生物试剂有限公司;黄连、黄芩、黄柏、苦参、木香、白头翁、诃子、泽泻、升麻、柴胡、黄柏、蒲公英、金银花、乌梅、藿香等均购自万和药房;细菌基因组DNA抽取试剂盒购自生工生物工程股份有限公司;胶回收试剂盒购自索莱宝科技有限公司;2×Taq PCR MasterMix、2000 DNA Ladder购自擎科生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器 PCR仪购自美国伯乐公司,离心机购自Beckman公司,超净工作台购自苏州净化设备有限公司,琼脂凝胶电泳仪购自北京市六一仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 鸽源沙门氏菌的分离培养 将采集的肠内容物及粪便分别无菌操作接种于LB肉汤中37℃振荡培养24 h,再分别接种于麦康凯培养基和SS培养基上,37℃培养24 h后,根据目标菌理论形态特征挑选单个菌落进行纯化培养后置于4℃冰箱保存。

1.2.2 细菌鉴定

1) 细菌形态学鉴定。取纯化培养的单个菌落进行革兰氏染色观察。

2) 细菌生化鉴定。将分离菌与标准菌株分别接种于麦芽糖、枸橼酸盐、吲哚、蛋白胨水、葡萄糖、乳糖、尿素、甘露醇、氯化钾、H2S等微量生化管,置于37℃恒温箱培养24 h后,观察结果。

3) 16SrRNA基因的扩增及测序。按照DNA提取试剂盒说明书对分离细菌进行DNA提取,以提取的DNA为模板进行PCR扩增,引物序列为F,5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGA-3′;R,5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTAGC-3′。

PCR反应体系50 μL：ddH2O 25 μL,2×PCRmix 20 μL,基因组DNA模板4 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL。反应条件：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸80 s,共30个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,产物使用胶回收试剂盒回收纯化后送擎科生物技术有限公司测序,测序结果通过BLAST检索系统,利用DNA star进行同源性分析,并构建系统发育树。

1.2.3 自拟中药复方药液制备 自拟5个中药复方,方一由黄连、金银花、木香、藿香等中药组成,方二由白头翁、黄柏、黄芩、蒲公英、乌梅等中药组成,方三由连翘、蒲公英、夏枯草等中药组成,方四由白头翁、鱼腥草、金银花、乌梅、诃子、白术等中药组成,方五由黄芩、秦皮、诃子、柴胡等10味中药组成。采用传统水煎法制备中药组方制剂[10],各方按比例配好使用水煎法使每方药液含生药1 g/mL,分装于离心管内3 000 r/min,离心30 min,取上清液装于西林瓶,121℃灭菌20 min,4℃避光保存。

1.2.4 药敏试验

1) 抗生素敏感性试验。采用纸片法,吸取20 μL纯培养后的菌液均匀涂抹在培养基上,放置药敏纸片,37℃恒温培养24 h后,观察、测量抑菌圈的直径,按美国临床和实验室标准协会(CLSI)药酶纸片规则标准判定。

2) 中药复方的敏感性试验。采用牛津杯法,吸取上述菌液20 μL均匀涂抹在培养基上,放置于无菌牛津杯,加入中药复方液200 μL(1 g/mL),每个复方做平行对照,37℃培养24 h后,观察、测定抑菌圈的直径(mm)。敏感性判定标准：抑菌直径≥20 mm为极敏感;15 mm≤抑菌直径<20 mm为高敏;10 mm≤抑菌直径<15 mm为中敏;抑菌直径<10 mm为低敏或无效。

2 结果与分析

2.1 菌株的初步鉴定

通过麦康凯、SS培养基培养及革兰氏染色,分离菌呈直径1～2 mm表面光滑、边缘齐整的圆形菌落。经镜检观察,菌体呈小短杆菌形态,革兰氏染色阴性,特性与沙门氏菌相符合(图1～2),初步判定分离菌株为沙门氏菌。

图 1 分离菌在培养基上的菌落形态Fig.1 Colony morphology of the isolated strain on medium

图 2 分离菌革兰氏染色形态(10×100)Fig.2 Gram staining morphology of the isolated strain (10×100)

2.2 菌株的生化鉴定

由表1可见,分离株与沙门氏菌标准株生化鉴定结果相一致,进一步验证分离菌株为沙门氏菌。

表1 菌株的微量生化鉴定Table 1 Microbiochemical identification of the isolated strain

2.3 16SrRNA基因扩增及测序结果菌株的分子鉴定

PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳后,获得大小约为1 500 bp条带,与预期片段(1481bp)大小相符(图3)。同源性分析显示(图4～5),分离菌16SrRNA序列与6-996 Salmonella entericasubsp的同源性为99.2%,说明该分离菌为沙门氏菌。

注：M,DNA分子量标准(DL 2 000);1,分离菌扩增条带。Note：M,DNA marker (DL 2 000);1,amplification band of the isolated strain图 3 菌株16SrRNA PCR扩增图谱Fig.3 PCR amplification chromatogram of 16SrDNA strain

图 4 分离菌株的同源性Fig.4 Homology analysis of the isolated strain

图 5 分离株基因的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of the isolated strain

2.4 菌株的抗药性

2.4.1 抗生素药酶纸片试验 由表2可见,分离菌对恩诺沙星等4种喹诺酮类药物、庆大霉素、大观霉素、头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮敏感,对阿莫西林、克林霉素、新霉素呈中度敏感,对其他试验药物表现为耐药。

表2 分离菌药敏纸片试验Table 2 Drug-sensitive paper test of the isolated strain

2.4.2 自拟中药复方敏感试验 从抑菌圈结果判定(表3)：方四对分离菌呈高敏,方二、方三、方五对分离菌为中敏,方一对分离菌为低敏。

表3 自拟中药复方对分离菌的体外抑菌效果Table 3 In vitro antibacterial effect of self-desined compound traditional Chinese medicine against the isolated strain

3 讨论

在世界范围内,沙门氏菌是危害较严重的食物源性病原菌之一,有30%甚至更高食物源性细菌污染由其引发,做好该菌的防控对公共卫生极其重要[11]。肉鸽主要感染鼠伤寒沙门氏杆菌缺乏菌体抗原5的哥本哈根变种[3],该变种有通过食物链传播给人类的风险[12]。随着近年国内肉鸽养殖业兴起,肉鸽沙门氏菌病危害程度日益凸显,梁德媚等[13]对上海农贸市场肉鸽群体调查发现,沙门氏菌分离率为26.1%;在广东、北京等地区近年也均从鸽病样中检测到沙门氏菌[14-15]。在此形势下,养殖场常用抗生素治疗鸽沙门氏菌病,耐药问题越发突出,病原菌对所用抗生素的耐药性逐渐加强,使抗生素的治疗效果降低,疗程延长,影响其预防和治疗效果[16];除此之外,抗生素的大量使用导致产品中药物残留超标[17],通过食品危害人类健康,或影响产品出口贸易,造成严重的经济损失[18]。因此,探寻高效、安全的抗生素替代品,是当前疾病防控研究的热点之一。

中药在养殖业中具有极大的应用潜力,中药具有多种抑菌活性,耐药性低,同时兼具资源丰富、毒副作用小等特点[19]。目前,研究人员发现五倍子、石榴皮、黄芩、天葵、金银花等多味单药及中药组方制剂对畜禽沙门氏菌具有良好的抑制作[20-25]。分离沙门氏菌株显示耐药表型多样性,提示了抗生素科学、合理使用紧迫性;同时针对该分离菌筛选到敏感中药复方,为临床治疗鸽沙门氏菌用药提供依据,但临床效果有待进一步验证。

4 结论

根据细菌培养的特性、革兰氏染色观察、PCR扩增测序结果判定试验分离的菌株为沙门氏菌,分离菌对恩诺沙星等4种喹诺酮类药物、庆大霉素、大观霉素、头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮敏感,对阿莫西林、新霉素、克林霉素呈中度敏感,对其他试验药表现为耐药;同时展开自拟中药复方对沙门氏菌的体外抑菌试验,判定方四(白头翁、鱼腥草、金银花、乌梅、诃子、白术等中药)对分离菌呈高敏,方二(白头翁、黄柏、黄芩、蒲公英、乌梅等中药)、方三(连翘、蒲公英、夏枯草等中药)、方五(黄芩、秦皮、诃子、柴胡等10味中药)对分离菌为中敏,方一(黄连、金银花、木香、藿香等中药)对分离菌为低敏。