不同品种猪PVALB 基因多态性及其在肌肉组织的表达差异分析

韩雨晴，薄素雪，严飞飞，段梦琪，强巴央宗，商 鹏

（1.西藏农牧学院 动物科学学院，西藏 林芝 860000；2.西藏特色农牧资源研发省部共建协同创新中心，西藏 林芝 860000）

骨骼肌的生长发育对于畜禽生长发育有着重要的影响。骨骼肌是机体重要的运动和能量代谢组织，对于维持机体代谢平衡和稳态起到重要作用[1]。骨骼肌是一种高度异质的组织，主要是由骨骼肌细胞、周围结缔组织以及神经组织构成[2]。在哺乳动物中骨骼肌约占机体质量的三分之一，是机体新陈代谢、运动及调节体温的重要组织[3]。

小白蛋白（Parvalbumin，PVALB）是一种分子质量为0～12 ku 的球状α-螺旋小蛋白[4]，属于EFHand 家族，是一种钙转运体/穿梭蛋白[5]，1973 年，PVALB首次从鲤鱼肌肉中分离出来[4]。PVALB 蛋白主要调控肌肉松弛的过程，在大脑、骨骼肌、心肌、甲状旁腺和肾脏中表达量显著高于其他器官组织[6‐7]。EF-Hand 家族蛋白质的特征是具有保守的螺旋-环-螺旋结构单元，该类蛋白质由Ca2+螯合环桥接的α-螺旋组成[8]。EF-Hand家族蛋白质参与许多关键细胞过程的调节，包括基因转录、蛋白质磷酸化、核苷酸代谢和离子转运[9]。而PVALB 存在于快速收缩和快速松弛的骨骼肌纤维中，并且与两栖动物和鱼类的肌肉松弛速度呈正相关[10‐11]。AYUSO等[12]采用Transcriptome 技术对纯种伊比利亚猪和杜洛克杂交猪（IBDU）进行差异表达基因筛选，发现PVALB基因与猪的骨骼肌生长发育相关，并对猪生长性状产生明显影响。

藏猪是中国高原地区特有的小型地方品种，耐低氧，抗高寒，遗传多样性丰富，肉质风味独特[13]；而大约克猪是著名的瘦肉型猪种，具有生长速度快、饲料利用率高和瘦肉率高等特点[14]。鉴于此，对藏猪和大约克猪的PVALB基因进行单核苷酸多态性（SNP）及组织表达差异分析，探究PVALB基因对藏猪肌肉组织生长发育的影响，旨在为藏猪的分子育种研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

采集西藏农牧学院实习牧场[西藏林芝地区（海拔约2 900 m）]饲养的180 日龄藏猪（TP）和林芝宇高生态农业开发有限公司养殖基地[西藏林芝地区（海拔约2 900 m）]饲养的180 日龄大约克猪（YP）耳组织进行基因组DNA 的提取。共采集66 份（藏猪36 头，大约克猪30 头）耳组织样品，放入装有75%乙醇的离心管中，于-20 ℃冰箱保存。选取同期饲养至30 日龄、90 日龄及180 日龄且生长情况相近的藏猪、大约克猪各8头进行屠宰，分别取其腿肌和背最长肌组织，剪黄豆大小放入装有RNA 保存液的冻存管中，置于液氮中快速冷冻，用于组织总RNA 的提取。

1.2 DNA、RNA的提取以及cDNA制备

猪耳组织样品用苯酚氯仿抽提法提取总DNA，提取完成后使用RNase-Free ddH2O 溶解，再使用1%琼脂糖凝胶电泳和Nano Drop 2000 分光光度计检测DNA 质量和浓度，将可用于后续试验的DNA于-20 ℃保存。

腿肌及背最长肌组织用RNAiso Plus 试剂法提取组织RNA，提取完成后用RNase-Free ddH2O 溶解，再使用1%琼脂糖凝胶电泳和Nano Drop 2000分光光度计检测RNA 质量和浓度，所提取好的RNA于-80 ℃保存。

cDNA 制备根据快速反转录试剂盒（KR180123）说明书进行。gDNA 去除反应体系：5×gDNA Buffer 2 µL，总RNA 根据比例计算出用量，RNase-Free ddH2O 补足至10 µL。反转录体系：上述gDNA 去除及应体 系10 µL、10×Fast RT Buffer 2µL、RT Enzyme Mix 1 µL、FQ-RT Primer Mix 2µL，RNase-Free ddH2O 补足至10 µL。反转录结束后-20 ℃保存备用。

1.3 SNP筛选引物设计与合成

登录GenBank 网站（htttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank），下载猪PVALB基因（登录号：NC_010447.5）起始密码子上游2 000 bp 区域的DNA 序列，采用Primer Premier 5.0 软件设计5′UTR 的引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物合成后用RNase-Free ddH2O 溶解，于4 ℃保存。

表1 PVALB基因5′UTR SNP筛选引物信息Tab.1 The primer information for SNP screening of PVALB gene 5′UTR

1.4 PVALB基因PCR扩增

以提取的藏猪和大约克猪耳组织DNA 为模板，扩增PVALB基因的5′UTR 区域。PCR 反应体系：2×TaqPCR Master Mix Ⅱ10 µL、RNase-Free ddH2O 8µL、上/下游引物0.5µL、DNA 模板1µL，共20µL。PCR 反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，59.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行38 个循环；72 ℃延伸4 min，4 ℃保存。

最后将PCR 产物使用1%琼脂糖凝胶进行电泳，经检验合格后的PCR 产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.5 SNP基因频率、基因型频率与转录因子预测

混池测序分析基因的单核苷酸多态性，筛选出SNP 突变位点后，根据筛选的突变位点扩大个体进行个体测序。使用Excel 分别计算各个SNP 位点的基因型频率以及等位基因频率。用JASPAR 在线网站（htttp://jaspar.binf.ku.dk/）进行SNP 位点突变前后转录因子预测。

1.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）引物设计与合成

登录GenBank 网站（htttp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）下载猪PVALB基因的mRNA 序列，选用β-actin作为内参基因，利用Primer Premier 5.0 软件设计引物（表2），由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物合成后用RNase-Free ddH2O 溶解，于4 ℃保存。

表2 PVALB基因实时荧光定量PCR引物信息Tab.2 The primer information for real‑time fluorescence quantitative PCR of PVALB gene

1.7 实时荧光定量PCR检测

选取检验合格的PVALB基因cDNA 为模板，选取β-actin基因为内参基因，每个个体样品各设置3个重复。采用20 µL 的反应体系对PVALB和β-actin进行实时荧光定量PCR 扩增。采用Livak 法计算PVALB基因在组织中的相对表达量。

1.8 数据处理

运用Excel 软件计算各个突变位点的基因频率和基因型频率，使用卡方检验对PVALB基因的基因型频率和基因频率进行差异显著性分析；利用Sigma plot 软件对PVALB基因相对表达量进行双因素（品种和组织）分析，以平均值±标准差作图，并利用SPSS 25.0 软件对PVALB基因表达量进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 藏猪和大约克猪PVALB基因PCR扩增结果

提取藏猪和大约克猪的DNA、RNA 条带清晰，无杂带、拖尾情况，同时无蛋白质污染，使用Nano Drop 2000 检测DNA、RNA 质量，OD260/280和OD260/230值均在1.8～2.0，可满足后续要求。以提取的DNA为模板进行PVALB基因的5′UTR 扩增，可见清晰的目的条带，大小为840 bp（图1），与目的条带大小相符。

图1 藏猪和大约克猪PVALB基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of PVALB gene fromTibetan and Yorkshire pigs

2.2 藏猪和大约克猪PVALB基因SNP筛选与转录因子预测

通过测序比对（图2），发现PVALB基因5′UTR共有2个突变位点，分别标记为G1659C、C1269T。

图2 藏猪和大约克猪PVALB基因SNP筛选Fig.2 SNP screening of PVALB gene in Tibetan and Yorkshire pigs

基因型频率、基因频率及卡方检验结果如表3所示。在藏猪中，突变位点G1659C 存在GG、GC、CC 型，C 基因为优势等位基因；在大约克猪中存在GG、GC、CC 型，G 基因为优势等位基因。在突变位点C1269T 中，藏猪和大约克猪均存在CC、CT、TT型，C基因为优势等位基因。

表3 藏猪和大约克猪PVALB基因SNP位点基因型频率及卡方检验Tab.3 Genotypic frequency and chi‑square test of SNP locus of PVALB gene in Tibetan and Yorkshire pigs

PVALB基因2 个突变位点（G1659C 和C1269T）均符合哈迪-温伯格（Hardy-Weinberg）平衡（P˃ 0.05）。在藏猪和大约克猪中，G1659C（χ2=6.667，P=0.0357）和C1269T（χ2=7.862，P=0.020）突变位点均存在显著差异（P˂0.05）。

本试验对PVALB基因的SNP 位点进行转录因子预测，PVALB基因G1659C 位点突变后NRF2 转录因子结合位点消失，并出现了新的转录因子NR1D1结合位点。C1269T 位点突变后NCOR1 转录因子结合位点消失并出现了新的转录因子OTX2结合位点。

2.3 藏猪和大约克猪PVALB基因在不同肌肉组织中的相对表达量

利用实时荧光定量PCR 技术对PVALB基因在藏猪和大约克猪腿肌、背最长肌中的表达水平进行检测，结果如图3 所示。从图3 可以看出，在腿肌中90 日龄时PVALB基因表达量最高，30、180 日龄次之；在背最长肌组织中180 日龄时PVALB基因表达量最高，30、90日龄次之。在腿肌和背最长肌这2个组织中，PVALB基因的表达量大约克猪显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）高于藏猪。

图3 藏猪和大约克猪PVALB基因在腿肌（a）和背最长肌（b）中的表达量Fig.3 Expression levels of PVALB gene of Tibetan and Yorkshire pigs in leg muscle（a）and longissimus dorsi muscle（b）

3 结论与讨论

PVALB 是肌肉组织生长发育、调节机体代谢平衡的重要蛋白质，是关键细胞过程的重要成分[15]。LIAN 等[16]研究结果表明，Ca2+通过决定钙蛋白酶活性在肌肉生长中起关键作用，并通过减少Ca2+与原肌球蛋白-肌钙蛋白复合物的结合来促进肌肉的生长发育。本研究在PVALB基因起始密码子上游2 000 bp 区域中发现突变位点G1659C 和C1269T，2个突变位点基因型频率和基因频率在藏猪和大约克猪中存在显著差异。通过对2 个突变位点进行转录因子功能预测，发现新增的转录因子大多与组织代谢、生长发育、细胞分化密切相关，如转录因子NR1D1 是核受体超家族中的一员，该基因在哺乳动物的骨骼肌、大脑和肝中表达，参与肌肉生长和细胞分化等生理过程[17‐19]；转录因子OTX2是一种含有同源结构域的转录因子，参与细胞增殖、分化、凋亡等过程，在YUE 等[20]的研究中，利用RNA-seq 技术证实OTX2 调控猪胚胎肌肉生长发育过程。综上，G1659C 和C1269T 位点可能与猪肌肉的生长发育相关。

本研究通过对藏猪和大约克猪的背最长肌和腿肌进行实时荧光定量PCR 检测，发现PVALB基因在90 日龄腿肌中的表达量最高，PVALB基因mRNA表达量在藏猪和大约克猪中均位于最高水平，该时间节点属于猪的快速生长阶段，说明PVALB基因在促进猪肌肉快速生长发育中起到重要作用；在背最长肌中，PVALB基因表达量在整个生长发育阶段中处于上升趋势，与机体生长发育规律趋势一致，且在180 日龄处于最高水平，说明PVALB基因对藏猪和大约克猪肌肉生长发育具有正调控作用。且有研究显示，禁食30 d 处理后，鱼肌肉中PVALB基因的表达量降低，表明该基因与肌肉的生长发育呈正相关[21]。由此推测PVALB基因为猪生长发育关键上调基因。

综上，本研究发现PVALB基因5′UTR 区域存在2 个SNP 位点G1659C 和C1269T，该位点突变前后消失和新增的转录因子均与肌肉生长发育相关，PVALB基因在不同日龄大约克猪背最长肌和腿肌中mRNA 相对表达量均显著或极显著高于藏猪，结合SNP结果和RT-qPCR 结果推测，PVALB基因有促进猪肌肉生长发育的功能，可作为骨骼肌早期发育和肉质性状研究新的候选基因，为后续阐明其在猪生长发育中的分子作用机制提供了理论依据。