基于数据挖掘、网络药理学和分子对接探究中医药治疗房颤的核心中药及机制

邓良英，孙园园，高磊，王炜，石开虎※

（1.南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210028；2.江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028）

房颤（Atrial fibrillation, AF）是临床上常见的心律失常，与死亡、中风和外周栓塞疾病风险增加有关[1]。过去20 年其发病率和患病率显著增加，引起了严重的经济负担，也成为流行病学和公共卫生最大的挑战之一[2]。据估计，在中国40 岁以上成年人的房颤患病率为2.31%[3]。然而，关于房颤的形成和持续存在机制仍没有确切的定论，可能与心房组织的电生理和结构重构有关[4]。目前，临床上治疗房颤有心率控制、节律控制以及预防血栓栓塞事件[5]等方法，然而，对于老年人而言往往面临抗凝药物不耐受、抗心律失常药物产生不良副作用、射频消融等手术费用高以及术后复发等问题[6]。中医药具有多种治疗方法，越来越多的研究显示，中医药可能成为房颤的有效预防手段和补充疗法[7]。一些中药、中成药或者活性成分在房颤治疗的四项原则中发挥积极作用，可减轻患者胸闷、心悸和呼吸困难症状，提高患者的耐受性[8]。据研究显示，一些中药或者其活性成分作用于心房肌细胞，从而避免心律失常，其可能是通过调节离子通道[9]，抑制炎症因子[10]，氧化应激等起作用[11]。因中药具有成分复杂、多靶点的作用特点，治疗房颤的作用机制目前尚不清晰。本研究通过回顾数据，挖掘房颤现代中医药用药规律，并针对核心药对展开网络药理学、分子对接和分子动力学研究，为其治疗房颤的活性成分及作用机制提供依据。

1 材料和方法

1.1 资料来源

以中国知网、万方、维普和中国生物医学网为数据来源，以“主题词=（房颤OR 心房颤动OR 心房纤颤）AND 主题词=（中医OR 中药OR 中西医OR 方药OR 医OR 经验OR 验案OR 临床OR 疗效OR 观察）进行高级检索，检索时间从建库至2021 年12 月。

1.2 处方筛选

1.2.1 纳入标准 明确诊断为“心房颤动”或“房颤”或“心房纤颤”或“AF”；有明确疗效且总有效率超过85%；文献中有中药复方治疗房颤，并有明确药味组成；仅采用内服为服药方式。

1.2.2 排除标准 动物或者细胞试验等非临床研究；复方组成相同或者重复发表的文献只取一篇研究单味中药的文献。

1.2.3 筛选结果 经过纳入和排除标准，最终纳入文献为161 篇文献，整理后得到156 首方剂。

1.3 处方录入和药名规范

整理获得的处方通过Microsoft Excel 2010 录入，建立房颤方剂数据库，由两人进行录入资料，数据审核，以确保数据准确性。参照《中华人民共和国药典》（2020 年版）、《中药学》和《中医大辞典》等对方剂中的药材名称进行规范化处理，比如“炒白术”规范为“麸炒白术”，“麦门冬”规范为“麦冬”，“三七粉”规范为“三七”，“当归身”、“当归尾”统一规范为“当归”等。

1.4 用药频次和关联规则分析

运用IBM SPSS Statistics 26 对纳入处方的用药频次和频率进行统计分析；运用IBM SPSS Modelar 20.0 软件进行关联规则分析，通过Apriori 关联规则算法对处方中药物的用药规律和配伍规律进行分析。设置前项为2，后项为3，得到核心药对或者药物组合。

1.5 网络药理学

通过TCMSP 数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）对经过1.4 分析后得到的核心药对”苦参—丹参”活性成分进行筛选，以获得药物作用靶点。然后，利用TTD（http://db.idrblab.net/ttd/、GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）和DrugBank（https://go.drugbank.com/）数据库以“atrial fibrillation”为关键词获得房颤疾病靶点。将房颤靶点与药物靶点的交集上传到String 数据库（https://cn.string-db.org/）以构建PPI网络，并通过Metascape数据库（https://metascape.org/）进行富集分析，借助Cytoscape 3.9.1 软件进行可视化处理。

1.6 分子对接

利用PDB（https://www.rcsb.org/）数据库下载靶点PDB 文件，利用PyMOL 对受体蛋白去除配体、去水等操作；利用Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载药物活性成分的SDF 文件，然后，通过open babel 软件把文件转为Mol2 格式；通过AutoDockTool-1.5.7 对配体和蛋白进行加氢、平衡电荷等操作，保存为pdbqt格式；利用AutoDockTool-1.5.7 进行对接，并计算能量，最后通过Discovery Studio2019 绘图。

1.7 分子动力学模拟

使用GROMACS2020.6 软件包对1.6 分析的分子对接结果进行分子动力学模拟，分析潜在活性成分与蛋白的结合模式。首先，从Biobyte（https://www.bio2byte.be/acpype/submit/）将小分子文件转换为分子结构文件和拓扑文件。使用charmm36 力场以及TIP3P周期性显性水模型进行模拟，形成蛋白原子距离边缘为12大小合适的盒子，加入相应的NaCl 离子保证模拟系统电荷中性，在系统的三个方向都应用周期边界条件。模拟前对体系采用最速下降法进行50 000 步分子动力学优化，然后体系逐渐升温到310K，在310K下所有体系在NVT 系综下进行1 ns 的平衡；同样，在310 K 和1 atm 压强下所有体系在NPT 系统下进行1 ns 平衡，所有体系在NPT 系统下进行模拟时间为100 ns、模拟间隔为2 fs 的分子动力学模拟。

2 结果

2.1 数据挖掘结果

2.1.1 用药频次和频率分析 对房颤处方进行规范录入，共得到194 味中药，累计频次到达1 546 次，对中药频次≥20 次进行汇总，共得到22 味中药，累计频次到达856 次，占比55.36%，其中在156 个处方中排名前五的中药分别为：丹参（75 次，48.08%）、炙甘草（72 次，46.15%）、麦冬（64 次，41.03%）、桂枝（52 次，33.33%）和当归（49 次，31.41%），结果见表1。

表1 房颤治疗用药频次分析（使用频次≥20 次）Table 1 Drug frequency analysis of treatment on atrial fibrillation(drug with frequency ≥20 times)

2.1.2 药物关联规则分析 对高频中药（频次≥20次）进行关联分析，设置最低条件支持度为10%，最小置信度为0.75，得到常用药材组合14 组，出现前五最高的频度配伍分别是：丹参—苦参、麦冬—五味子、麦冬—五味子—炙甘草、炙甘草—桂枝—麦冬、麦冬—地黄—炙甘草，结果见表2。“丹参—苦参”的支持度最高、置信度也较高，故将“苦参—丹参”定义为核心药对。

表2 高频药物关联规则分析Table 2 Analysis of association rules among high-frequency drugs

2.2 网络药理学结果

2.2.1 “丹参—苦参”的活性成分和靶点收集与筛选根据类药性（DL）≥0.18 和口服吸收利用度（OB）≥30%，获得“苦参—丹参”药对活性成分83 个，其中丹参59 个，苦参24 个，两者有一个重复活性成分（表3）。活性成分靶点去除重复值共获得117 个靶点。

表3 “丹参—苦参”活性成分Table 3 Active ingredients of "Salvia miltiorrhiza-Sophora flavescens"

2.2.2 药物—疾病靶点交集 通过TTD、GeneCards、OMIM 和DrugBank 数据库检索分别获得房颤疾病靶点23 个、1 124 个、351 个和120 个，去除重复共获得1 288 个疾病靶点。利用微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）绘制药物活性成分靶点与疾病靶点交集（图1），获得药物作用房颤核心靶点109 个。构建房颤核心靶点—活性成分—药物网络（图2）。根据拓扑分析度值排名前三的活性成分有槲皮素（度值=80）、木犀草素（度值=64）、丹参酮ⅡA（度值=21），这3 个成分为关键活性成分。

图1 “丹参—苦参”药对与房颤的韦恩图Fig.1 Venn diagram of"Radix salvia-Sophorae flavescentis radix"and atrial fibrillation

图2 房颤核心靶点—活性成分—药物网络Fig.2 Core target of atrial fibrillation-active ingredient-drug network

2.2.3 PPI网络分析及核心靶点筛选 将109 个房颤核心靶点导入String 数据库分析，得到PPI 网络数据，通过Cytoscape 构建PPI 网络，结果共获得108 个节点，1 778条边。由于靶点太多，所以根据度值（Degree）、平均中心度（Betweenness Centrality, BC），紧密度（Closeness Centrality, CC）得到15 个节点，104 边的PPI网络（图3）。根据度值把前6 作为关键靶点，见表4。

图3 “丹参—苦参”作用房颤核心靶点PPI 网络Fig.3 PPI network diagram of core targets of Salvia miltiorrhiza and Sophora flavescens on the treatment of atrial fibilliation

表4 核心靶点PPI 度值前6 位Table 4 Top 6 degree values of core targets in PPI network

2.2.4 房颤核心靶点的GO 功能和KEGG 通路富集结果 通过Metascape 数据库对“丹参—苦参”治疗房颤的核心靶点进行GO 分析。一共获得417 条GO 功能，其中，190 条生物过程（Biological Process,BP），136条分子功能（Molecular Function,MF），91 条细胞组分（Cellular Component,CC）。BP 主要富集在激素应答、细胞迁移、蛋白质磷酸化和机体活动调节等；MF主要富集在激酶结合、转录因子结合、脂质结合和信号受体活性调节等；CC 主要富集在膜筏、膜微结构域、细胞外基质和内质网等，见图4。

图4 “丹参—苦参”治疗房颤作用靶点GO 功能分析Fig.4 GO function analysis of the targets of"Salvia miltiorrhiza-Sophorae flavescentis"in the treatment of atrial fibrillation

通过Metascape 数据库对丹参—苦参治疗房颤的核心靶点进行KEGG 通路富集分析。以P ≤0.05 为标准进行筛选，按P 值从大到小对进行排序，可视化展示排名前20 的通路（图5）。发现NF- B信号通路、cGMP-PKG信号通路、AMPK等通路为“丹参—苦参”治疗房颤的关键通路。

图5 “丹参—苦参”作用房颤核心靶点的KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of the core targets of"Salvia miltiorrhiza-Sophorae flavescentis"in the treatment of atrial fibrillation

2.3 分子对接结果

将“2.2.2”项获取的关键活性成分槲皮素、木犀草素和丹参酮ⅡA与“2.2.3”获得的关键靶点TNF、IL-6、AKT1、VEFA、IL-1 和CA3P3 进行分子对接。当受体与配体的结合构象稳定时，能量会越低，结合能越小，对接结果见图6。当对接结合能≤ 29.288 kJ/mol 利用PyMOL 进行可视化分析（图7）。

图6 分子对接结合能热图Fig.6 Heat map of binding energy by molecular docking

图7 结合能分子对接结果Fig.7 The results of molecular docking with binding energy

2.4 分子动力学模拟结果

为了阐明AKT1 和丹参酮ⅡA 对接复合物之间的蛋白质配体稳定性。本研究对结合能最高的分子对接结果AKT1 —丹参酮ⅡA 进行分子动力学模拟。如图8A 示，经过100 ns 的模拟，复合物RMSD 在40 ns后逐渐趋向于稳定，65 ns 后几乎恒定，处于0.45 nm稳定范围内。蛋白与配体复合物的活性位点残基（Trp80 A、Leu264 A、Lys268 A、Ser205 A、Val270 A、Tyr210 A 和Leu272A）的RMSF 值为（0.13±0.06）nm，表现出稳定性（图8B）。在整个模拟过程中，丹参酮ⅡA 与Ser205 A 形成了稳定的氢键，在60 ns 之后几乎没有变化（图8C）。经过100 ns模拟的复合物（图8D），稳定状态下AKT1 —丹参酮ⅡA 相互作用力包括：SER 205 与配体形成氢键；TRP 80 与配体间的Pi-Pi疏水堆积作用；VAL 270、TYR 与配体的Pi-Alkyl 疏水作用。

图8 AKT1 和丹参酮ⅡA 分子动力学（MD）模拟分析Fig.8 Molecular dynamics (MD)simulation analysis of tanshinone ⅡA and AKT1

3 讨论

房颤在中医名为“心动悸”，归属于“心悸”、“怔忡”等范畴，其临床表现为心悸、眩晕和胸痹等病症[12]，多因心之阴血亏虚或者心气不足，心主血脉功能受影响，导致心脉不畅，脉络淤滞，心失所养导致[13]。在数据挖掘中，中医用药频次统计显示，前五的中药有丹参、炙甘草、麦冬、桂枝和当归，其中丹参的方剂占比达到48%；对高频药物进行Apriori 建模，根据频数、支持度、置信度将“丹参—苦参”作为核心药对。丹参性寒、味苦，具有益气、活血化瘀功效，苦参具有清热燥湿、利尿等功效。现代药理学显示，丹参可以减少钙离子内流，延长心肌动作电位时间，从而达到抗心律失常[14]。苦参中主要含有生物碱、黄酮类等成分，能很好调节钙通道、钾通道等抑制房室折返性心动过速的发生，或抑制房室传导，延长心肌细胞的有效不应期[15]。从微观层面来讲，利用“苦参 丹参”对房颤进行网络药理学分析，得到的前三核心成分为槲皮素、木犀草素和丹参酮ⅡA。槲皮素可能通过促进miR-135b 表达，抑制TGF- /Smads通路，抑制心房组织纤维化，从而减轻房颤[16]。丹参酮ⅡA 可以通过降低血清TNF- ，抑制炎症因子的表达[17]。核心药对“丹参 苦参”治疗房颤的前6 核心靶点为TNF、IL-6、AKT1、VEGFA、IL-1 和CASP3。研究发现，TNF 家族是细胞因子家族，其炎症细胞因子TNF- 信号转导增加可能通过多种机制引起心律失常，可以促进心房电重构、结构和收缩重塑，而且TNF- 通过激活p38-MAPK 途径与耐力运动诱导的心房颤动有关[18]。研究表明，可以通过抑制IL-1诱导的IL-6 的释放，伴有AKT 降低，来预防大鼠的房颤[19]。TNF- 、IL-6 和IL-1 等炎症标志物与阵发性房颤转为持续性房颤相关，可能成为预测房颤的生物标志物[18]。富集分析表明，靶点主要参与激素应答、蛋白质磷酸化，影响转录因子的结合和信号活性受体调节等；在膜筏、膜微结构域和细胞外基质等发挥作用。核心信号通路可能作用NF- B 信号通路和cGMPPKG 等通路等发挥作用。NF- B信号通路可以通过下调心脏钠通道的转录，从而影响氧化应激，调节AF 离子通道、转录因子等，并可能成为AF 的作用靶点[20]。腺苷单磷酸激活蛋白激酶（AMPK）已被证明在脂肪酸和葡萄糖代谢的能量途径发挥作用，阵发性房颤激活AMPK 以增加GLUT1/4 的表达，抗纤颤作用成为心房颤动治疗的潜在靶点[21]。分子对接结果显示，槲皮素、木犀草素、丹参酮ⅡA 与各个靶点对接结合均≤-20.92 kJ/mol，表现较强的亲和力。结合性最好的是受体AKT1 和丹参酮ⅡA 的对接结合能为-38.62 kJ/mol，分子动力学模拟结果更加验证这一结果，作为房颤的潜在靶点。综上所述，本文对数据挖掘中医药治疗房颤的处方进行整理，基于关联规则得到用药规律及核心药对，并通过网络药理学、分子对接和分子动力学研究初步揭示“丹参—苦参”有效活性成分及治疗房颤的机制，为进一步“丹参—苦参”药对治疗房颤提供了理论依据。