基于JAK1/STAT3通路的寿胎丸对复发性流产小鼠细胞自噬的影响

牟珍妮 ，申思楠 ，唐丽 ，刘莹蝶 ，周紫薇 ，雷磊

1.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指与同一性伴侣在妊娠28周之前发生3次或以上的妊娠丢失[1]，是妊娠常见的并发症之一，给妊娠妇女造成极大身心痛苦。RSA的防治已成为国内外生殖领域研究的重点。因此，探索更加准确、安全、有效的RSA诊疗方法是临床亟需解决的难题。

RSA病因复杂，除染色体异常、解剖结构异常、内分泌紊乱、免疫因素等已知原因外，目前仍有40%～60%患者病因不明[2]。细胞自噬是一种高度保守的细胞行为，可以为细胞修复损伤的细胞器提供能量，参与生物体发育、免疫反应、代谢调节、细胞凋亡和衰老等多种过程[3]。越来越多研究表明，细胞自噬与RSA密切相关[4-8]，但细胞自噬与RSA的具体作用关系尚存在争议，且其参与RSA 的具体机制尚不清晰。JAK/STAT信号通路是RSA重要的信号转导通路，该通路中转录因子信号转导和转录激活因子3（STAT3）与细胞自噬密切相关。

寿胎丸出自《医学衷中参西录》，具有补肾安胎功效，寿胎丸联合西药治疗不明原因RSA临床疗效显著优于单纯西药治疗[9-10]。基础研究表明，寿胎丸具有改善黄体功能[11]，增强滋养层细胞增殖、侵袭、迁移能力[12]，减少细胞凋亡等作用[13-17]。本研究通过建立RSA小鼠模型，观察寿胎丸对RSA小鼠的妊娠保护作用，并从JAK1/STAT3信号通路和自噬角度探讨其可能作用机制，为临床治疗RSA提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

40 只SPF 级雌性CBA/J 小鼠及15 只SPF 级雄性DBA/2小鼠，体质量（20±2）g，均购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号SCXK（京）2019-0008；5只雄性BALB/c小鼠，体质量（20±2）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2019-0004。动物饲养于湖南中医药大学SPF 级实验动物中心，温度（22±2）℃，湿度（50±5）%，自由摄食饮水，光照/黑暗周期12 h。本实验经湖南中医药大学动物伦理委员会审批（LL2021032501）。

1.2 药物及制备

寿胎丸（菟丝子12 g，桑寄生6 g，续断6 g，阿胶6 g），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科。取菟丝子、续断、桑寄生饮片，加6～8倍量蒸馏水煎煮2 次，每次1.5 h，合并滤液，浓缩至相对密度为1.1～1.2（50～60 ℃）。加入乙醇使含醇量达65%，冷藏24 h，过滤，回收乙醇至无醇味。阿胶烊化，与浓缩后药液合并，过滤，加蒸馏水稀释至原药材浓度为1.5 g/mL。地屈孕酮片，荷兰Abbott Biologicals B.V.，批号364221，10 mg/片。取10 mg 地屈孕酮片溶于20 mL蒸馏水中，配制成0.5 mg/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

小鼠孕酮、β-人绒毛膜促性腺激素（β-HCG）ELISA试剂盒（上海抚生实业有限公司，批号分别为A119292-96T、A105057-96T），HE 染色液（白鲨生物，批号BL700B），BCA蛋白浓度测定试剂盒（武汉伊莱瑞特，批号E-BC-K318-M），Janus 激酶1（JAK1）、p-JAK1、STAT3、p-STAT3 抗体（Affinity Biosciences，批号分别为AF5012、AF2012、AF6294、AF3293），ATG5抗体（成都正能生物技术有限公司，批号381320），Beclin1、LC3抗体（Proteintech，批号分别为11306-1-AP、14600-1-AP），超纯总RNA提取试剂盒（杭州新景生物，批号5003050），反转录试剂盒、SYBR染料（苏州近岸蛋白，批号分别为E047、E096）。

Gel Doc XR+凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），Heraeus Fresco 17 型超速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司），Cytation3型多功能酶标仪（美国BioTek 公司），HM355S 型石蜡切片机（美国Thermo Fisher Scientific公司），T100TMThermal Cycler型RT-PCR 扩增仪（美国Bio-Rad 公司），Mini-PROTEAN Tetra型电泳槽、Mini Trans-Blot型转印槽（美国Bio-Rad公司），SW-CJ-1FD型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）。

2 实验方法

2.1 造模

40只雌性CBA/J小鼠分别与15只雄性DBA/2小鼠和5只雄性BALB/c小鼠按2∶1合笼交配，前者建立RSA小鼠模型（30只），后者建立正常妊娠小鼠模型（10只）。于合笼次日早晨对雌鼠进行阴道涂片，涂片出现大量精子或见阴道栓，记为妊娠第0日。

2.2 分组及给药

将30只RSA模型小鼠随机分为模型组、地屈孕酮组和寿胎丸组，每组10只；10只正常妊娠模型小鼠为空白组。妊娠第0日开始给药，寿胎丸组予寿胎丸药液12 g/kg灌胃，地屈孕酮组予地屈孕酮溶液4.55 mg/kg灌胃（相当于60 kg成人等效剂量），模型组和空白组予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续12 d。

2.3 取材

给药结束后麻醉小鼠，摘眼球取血，静置1 h，3 500 r/min离心15 min，取血清，于-20 ℃冰箱保存备用。采血后将小鼠固定于鼠板，腹部做“U”形切口，打开腹腔，钝性分离子宫，用眼科剪自宫角处打开子宫壁，小号弯镊剥离胚胎及胎盘，分离着床部位蜕膜组织，每只小鼠取3个胚胎蜕膜组织和胎盘组织固定于多聚甲醛，余下蜕膜组织分装于冻存管和离心管中，置于-80 ℃冰箱保存。

2.4 指标检测

2.4.1 胚胎丢失率

观察胚胎形态，以胚胎体积明显缩小，胎盘单位有明显出血或坏死为胚胎丢失标准[18]，计算胚胎丢失率。胚胎丢失率（%）=丢失胚胎数÷总胚胎数×100%。

2.4.2 子宫脏器系数

称量小鼠体质量，分离子宫后称量子宫质量，计算子宫脏器系数。子宫脏器系数（%）=子宫质量÷体质量×100%。

2.4.3 HE染色

将蜕膜组织和胎盘组织从多聚甲醛中取出，梯度乙醇脱水后石蜡包埋，切片（厚度3 μm），烤片，脱蜡，苏木素染色5 min，伊红染色3 min，流水返蓝，梯度乙醇复水，二甲苯透明后中性树脂封片。采用显微成像系统采集图像。

2.4.4 ELISA检测

按试剂盒说明书配制标准品及样品，依次加入样品、酶标试剂、洗涤液、显色剂A、显色剂B、终止液等试剂，酶标仪波长450 nm检测各孔OD值。根据标准曲线回归方程计算血清孕酮和β-HCG含量。

2.4.5 Western blot检测

将蜕膜组织制成匀浆，用含蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的RIPPA裂解液裂解，4 ℃、12 500 r/min离心15 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，配制浓度为20 μg/μL的蛋白上样液，依次进行电泳、转膜、封闭、洗膜，加入JAK1一抗（1∶2 000）、p-JAK1一抗（1∶2 000）、STAT3一抗（1∶2 000）、p-STAT3一抗（1∶2 000）、ATG5一抗（1∶2 000）、Beclin1一抗（1∶5 000）、LC3一抗（1∶3 000），4 ℃震荡孵育过夜。洗膜，二抗37 ℃震荡孵育60 min。加ECL荧光底物显色，曝光并采集图片，分析蛋白表达量。

2.4.6 实时荧光定量PCR检测

将蜕膜组织加入Trizol 研磨后用氯仿萃取RNA，反转录成cDNA。RT-PCR 反应条件：95 ℃、3 min；95 ℃、10 s，58 ℃、5 s，共40个循环。生成扩增曲线及熔解曲线，得出Ct 值，各目的基因的表达量以GAPDH为内参基因进行标准化，采用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 统计学方法

4 结果

4.1 寿胎丸对模型小鼠胚胎丢失率的影响

正常组小鼠子宫体颜色淡红，胚胎大小均匀、如串珠，胚胎无明显瘀血及出血情况；模型组小鼠子宫颜色黯红，胚胎发育不均匀，部分胚胎出现瘀血、坏死、吸收情况；地屈孕酮组和寿胎丸组小鼠胚胎发育情况较模型组明显改善，仅个别胚胎出现瘀血。见图1。

图1 各组小鼠胚胎形态

除地屈孕酮组1只小鼠见阴栓而未妊娠外，其余小鼠均成功妊娠。与正常组比较，模型组小鼠胚胎丢失率显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，地屈孕酮组和寿胎丸组小鼠胚胎丢失率显著降低（P＜0.01）。见表2。

表2 各组小鼠胚胎丢失率比较

4.2 寿胎丸对模型小鼠子宫脏器系数的影响

与空白组比较，模型组小鼠子宫脏器系数降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，地屈孕酮组和寿胎丸组小鼠子宫脏器系数升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表3 各组小鼠子宫脏器系数比较（±s）

表3 各组小鼠子宫脏器系数比较（±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲▲P＜0.01

组别空白组模型组地屈孕酮组寿胎丸组子宫脏器系数/%10.66±2.85 6.01±2.48**9.15±2.25▲▲9.38±2.17▲▲只数10 10 9 10体质量/g 25.30±2.04 23.18±0.87 25.25±2.39 25.98±1.44子宫质量/g 2.67±0.59 1.39±0.57 2.33±0.73 2.43±0.52

4.3 寿胎丸对模型小鼠蜕膜组织和胎盘组织病理形态的影响

正常组小鼠蜕膜组织细胞呈卵圆形，排列紧密，胞质丰富，核仁明显，血管分布均匀，管壁完整；模型组小鼠蜕膜组织细胞排列杂乱，胞核固缩、部分消失，胞质水肿，部分呈空泡样变，血管分布较少；地屈孕酮组和寿胎丸组小鼠胎盘组织细胞排列相对有序，细胞形态较规则，仅有少量细胞水肿坏死，血管分布较均匀，管壁完整。见图2。

图2 各组小鼠蜕膜组织形态（HE染色，×200）

正常组小鼠胎盘组织致密，细胞排列整齐，形态规则，细胞核呈椭圆形，胞质充盈，血管丰富，分布均匀，管壁完整；模型组小鼠胎盘组织疏松，细胞排列杂乱，部分细胞增生肥大，胞核固缩，胞浆广泛空泡样变，大量炎性细胞浸润，血管分布较少；地屈孕酮组和寿胎丸组小鼠胎盘组织细胞排列较整齐，细胞形态较规则，仅少量细胞出现水肿、核固缩，血管分布较均匀。见图3。

图3 各组小鼠胎盘组织形态（HE染色，×200）

4.4 寿胎丸对模型小鼠血清孕酮、β-人绒毛膜促性腺激素含量的影响

与空白组比较，模型组小鼠血清孕酮、β-HCG含量显著减少（P＜0.01）；与模型组比较，地屈孕酮组和寿胎丸组小鼠血清孕酮、β-HCG 含量显著增加（P＜0.01，P＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠血清孕酮、β-HCG含量比较（±s）

表4 各组小鼠血清孕酮、β-HCG含量比较（±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

β-HCG/（pg/mL）1 996.89± 85.24 1 766.33± 58.41**1 903.74±139.35▲1 894.48± 95.19▲组别空白组模型组地屈孕酮组寿胎丸组只数6666孕酮/（ng/mL）2.78±0.04 2.54±0.08**2.67±0.06▲▲2.71±0.09▲▲

4.5 寿胎丸对模型小鼠蜕膜组织JAK1/STAT3 通路蛋白及自噬相关蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组小鼠蜕膜组织p-JAK1、p-STAT3、ATG5、Beclin1蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）；与模型组比较，地屈孕酮组和寿胎丸组小鼠蜕膜组织p-JAK1、p-STAT3、ATG5、Beclin1 蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。见图4、表5。

图4 各组小鼠蜕膜组织JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3、ATG5、Beclin1、LC3蛋白免疫印迹

表5 各组小鼠蜕膜组织JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3、ATG5、Beclin1、LC3蛋白表达比较（±s）

表5 各组小鼠蜕膜组织JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3、ATG5、Beclin1、LC3蛋白表达比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.98±0.54 0.91±0.25*2.05±0.72▲2.01±0.60▲组别空白组模型组地屈孕酮组寿胎丸组只数3333 p-JAK1/JAK1 0.94±0.07 0.52±0.07**0.92±0.15▲▲0.87±0.11▲▲p-STAT3/STAT3 0.72±0.16 0.26±0.10**0.64±0.06▲▲0.65±0.17▲▲ATG5/GAPDH 1.43±0.26 0.57±0.27*1.36±0.48▲1.42±0.34▲Beclin1/GAPDH 1.46±0.20 0.91±0.27*1.52±0.31▲1.45±0.27▲

4.6 寿胎丸对模型小鼠蜕膜组织JAK1、STAT3、ATG5、Beclin1 mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组小鼠蜕膜组织JAK1、STAT3、ATG5、Beclin1 mRNA表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，地屈孕酮组和寿胎丸组小鼠蜕膜组织JAK1、STAT3、ATG5、Beclin1 mRNA 表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表6。

表6 各组小鼠蜕膜组织JAK1、STAT3、ATG5、Beclin1 mRNA表达比较（±s）

表6 各组小鼠蜕膜组织JAK1、STAT3、ATG5、Beclin1 mRNA表达比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别空白组模型组地屈孕酮组寿胎丸组Beclin1 1.00±0.09 0.13±0.02**0.81±0.05▲▲0.77±0.22▲▲只数3333 JAK1 1.02±0.23 0.26±0.12*0.70±0.05▲0.74±0.06▲STAT3 1.00±0.10 0.23±0.01*0.75±0.01▲▲0.76±0.04▲▲ATG5 1.02±0.25 0.23±0.03**0.77±0.10▲▲0.78±0.04▲▲

5 讨论

RSA是女性妊娠常见的并发症之一，发病率约为1%～5%[1]。RSA 属中医学“滑胎”“数堕胎”范畴，具有屡孕屡堕及应期而下的特点。肾主生殖，胞络系于肾，中医学认为滑胎本于肾虚所致冲任虚衰，胎失所养，胎结不实。《医学衷中参西录》寿胎丸是治疗RSA的经典方剂，由菟丝子、桑寄生、续断、阿胶四药组成。菟丝子滋补肝肾，益阴而固阳；桑寄生补肝肾，养血而固冲任，安胎；续断甘温助阳，补益肝肾、调理冲任、固本安胎；阿胶滋阴养血，止血。四药合用，共奏补肾安胎功效。临床和实验研究均表明，寿胎丸能改善RSA的妊娠结局[19-20]。本研究结果显示，寿胎丸干预能明显提高RSA小鼠的胚胎丢失率、子宫脏器系数，并能改善RSA小鼠蜕膜及胎盘组织病理状态，提示寿胎丸对RSA 小鼠具有明显的妊娠保护作用。

自噬通过泛素蛋白酶系统维持细胞内稳定，由双层膜性结构对细胞内成分进行包裹，之后通过与溶酶体结合从而将包裹的内容物进行分解、再利用[21-22]。研究发现，自噬反应活性失调对妊娠期并发症的发生存在不可忽视的影响[23]。卵母细胞受精、胚胎植入前后的发育，以及妊娠期并发症均涉及自噬的诱导，当滋养细胞早期处于炎症、缺氧和营养有限的环境下，自噬对其有重要的保护作用，利于其适应早期发育的微环境[24-25]。有研究显示，与正常妊娠孕妇胎盘绒毛组织相比，流产、子痫前期、胎儿生长受限、妊娠期糖尿病等病理妊娠的孕妇胎盘绒毛组织均出现自噬过程受损[4，26-28]。ATG5、Beclin1、LC3是自噬过程中3种标志性分子，其中ATG5和Beclin1是自噬体形成必需的蛋白，ATG5通过组成泛素化系统ATG5-ATG12-ATG16L介导自噬体的形成[29]，Beclin1通过参与组成PI3K复合体诱导细胞自噬[30]。当自噬发生时，胞浆型LC3-Ⅰ会酶解掉一小段多肽转变为膜型LC3-Ⅱ，其转化率增加与自噬小体数量增加有关，因此，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值大小可反映自噬水平高低[31]。本研究结果表明，RSA模型小鼠自噬相关分子ATG5、Beclin1蛋白及mRNA表达显著降低，且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显下调，而寿胎丸组及地屈孕酮组均升高，说明RSA与自噬过程受到抑制相关，而寿胎丸可能通过激活自噬起到妊娠保护作用。

自噬受多种信号通路调控，JAK/STAT通路是参与自噬的重要通路[32-33]。STAT3 是STAT 家族的重要成员，有研究显示，在小鼠妊娠的胚胎着床期，p-STAT3在胚泡植入部位的子宫内膜腺上皮和间质组织高表达，并且随着胚胎着床过程的进行，STAT3的表达及活化过程主要在蜕膜细胞内，推测STAT3可能在子宫内膜蜕膜化及胚胎着床过程中起关键作用。而敲除STAT3基因的小鼠在妊娠第7日胚胎即死亡[34]。本研究发现，RSA小鼠蜕膜组织p-JAK1、p-STAT3蛋白及mRNA表达降低，说明JAK1/STAT3通路激活被抑制，而寿胎丸组和地屈孕酮组p-JAK1、p-STAT3蛋白及mRNA表达较模型组均显著升高，表明寿胎丸可激活JAK1/STAT3通路，从而改善RSA小鼠的妊娠结局。

综上所述，寿胎丸可能通过调控JAK1/STAT3信号通路激活自噬，改善RSA蜕膜组织及胎盘组织病理状态、提高血清激素水平、降低胚胎丢失率，从而起到与地屈孕酮相似的保胎效果。但目前细胞自噬在RSA方面的研究仍处于起步阶段，对细胞自噬涉及的相关通路及具体机制仍不完全明确，且细胞自噬在RSA方面的研究仍存在一定争议，今后将进一步通过体外实验验证细胞自噬在RSA中的作用机制及寿胎丸的干预作用。