苹果内生促生真菌筛选及其促生特性

刘娟娟 郑娇 高成林 刘虹杉 张东华 刘丽

摘要：【目的】从苹果不同部位内生真菌中筛选具有促生潜力的菌株，为开发苹果益生真菌储备菌种资源，为探究苹果内生真菌与宿主互利共生关系提供试验基础。【方法】采用组织分离法获得内生真菌，基于ITS 序列鉴定到属种；筛选、比较菌株产IAA、铁载体等促生能力；回接潜力菌株于苹果组培苗，50 d 后观察组培苗生长情况。【结果】共分离获得内生真菌51 株鉴定为29 种。促生潜力筛选后，选取IAA 含量高、兼具促生功能多的5 株菌（LG06、PG06、LG12、LY09、PJ09）回接苹果组培苗。結果表明其中4 株内生真菌对苹果组培苗的促生效果明显，与对照相比，菌株PG06 的叶片数量、叶绿素含量、叶片总氮含量增高最多（p＜0.05），依次增加了61.17%、44.08%、42.56%。【结论】苹果内生真菌PG06、LG12、LG06、LY09 对苹果组培苗均具有显著促生作用，可进一步探索田间试验。研究为苹果生物肥料的研发提供了实验依据。

关键词：苹果；内生真菌；促生；组培苗

中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980（2023）04-0735-12

苹果（Malus pumila Mill.）是属于蔷薇科苹果属的落叶乔木，是我国第一大水果[1]。在苹果栽培中，常通过施用大量的化肥以提高其生产力，这不仅无法保证苹果的产量和质量，还会造成严重的环境影响[2]。生物肥料是微生物的活细胞，能为植物提供营养、控制病害，同时还能改良土壤，是化肥的最佳替代品[3]。利用植物微生物开发生物菌肥可实现减肥增效的直观效果，从而促进苹果产业的可持续发展。

植物及植物微生物共同构成了一个协调互作的单元，称为植物全功能体[4]。在长期的互作过程中，与植物紧密结合的微生物与微生物之间很可能也会进化出群落水平的互作策略，使它们能够在植物全功能体内持续存在，并在植物生长过程中发挥至关重要的作用[5]。植物内生真菌是指其生活史中一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织内部对植物无害的微生物。相比根际微生物（菌根真菌、共生菌或根围真菌），内生真菌在时间和空间上都存在优先权，它生活在植物组织内部可免受温度、渗透势和紫外线辐射等不利外部环境因素的影响[6-7]。其中，内生真菌为丝状生长，接触面积大，生物量大，可分解糖类、单宁等多种有机物，参与腐殖质的形成和分解、氨化作用和硝化作用等，因而对植物促生长、环境修复方面的效果优于内生细菌和内生放线菌[8-10]。由内生真菌制成的生物肥具有生物环境安全性和使土壤质量提高、保持生态平衡等特点，更适用于农业传统栽培系统[11]。

内生真菌对植物生长和发育的有益作用已有很好的证明，如内生真菌能产生生物控制剂、植物激素（吲哚乙酸、赤霉素、细胞分裂素等）、能产生次生代谢产物铁载体、水解酶等，在植物生长发育过程中发挥着重要的作用[12-13]。此外，内生真菌还能够改善土壤，并促进植物对营养元素的运输[7]。侯姣姣等[14]从古国槐叶片内分离筛选解磷内生真菌，回接后可侵染宿主无菌苗根部组织，建立共生关系，并影响宿主的叶绿素含量、可溶性蛋白质含量、相关防御酶活性等。Turbat 等[15]从苦参中分离出15 种内生真菌，筛选菌株的间接或直接促进植物生长能力，并进行体外评估。目前针对苹果内生真菌，大多学者以分离鉴定为基础，筛选苹果重要病害如苹果腐烂病[16-18]、炭疽病[19]、轮纹病[20]等的内生生防真菌。Liu 等[21]也对苹果内生真菌的群落多样性进行研究，表明受组织类型、品种和地点的影响，内生真菌的种类不同。但对苹果内生真菌的促生功能菌株研究方面还属空白。笔者在本研究中从红富士苹果不同组织部位分离内生真菌，并研究其产IAA、铁载体、溶磷、解钾、固氮等促生功能，为苹果的可持续栽培提供试验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

分离材料采自于西南林业大学树木园红富士苹果树（砧木为八棱海棠Malus robusta Rehder）的根、枝、叶，苹果树龄为15 年。供试培养基：PDA培养基、PDB培养基、孟加拉红培养基[22]、LB培养基、Kings B培养基、溶解无机磷（NPA）培养基、蒙金娜有机磷培养基、解钾培养基、MAS-CAS 琼脂培养基、阿须贝氏（Ashby）培养基[23-25]。

1.2 内生真菌的分离及鉴定

取红富士苹果树的根、枝、叶，用自来水冲洗干净，自然风干后剥离枝和根韧皮部，将根、枝、叶置于75%酒精中表面消毒30 s，5%的次氯酸钠溶液中浸泡（根4 min、枝3 min、叶2 min），最后无菌水中漂洗4 次，每次至少1 min。之后用灭菌滤纸吸干水分并剪成1 cm×1 cm 的小块，分别置于PDA、LB 和孟加拉红培养基，每皿放3 块，每处理3 个重复。取最后一次漂洗用的无菌水涂抹于PDA平板，对组织表面消毒效果进行验证。置于26 ℃培养箱中黑暗培养两周左右长出菌丝，挑取菌落边缘菌丝进行纯化，4 ℃低温斜面试管保存菌种。

内生真菌的鉴定：①形态学鉴定：内生真菌鉴定参考《真菌鉴定手册》[26]来进行初步的鉴定分析；②分子生物学鉴定：使用生工的Ezup 柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，按照试剂盒步骤提取内生真菌菌株DNA，用引物ITS4（5- TCCTCCGCTTATTGATATG-3）和ITS5（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）PCR 扩增菌株DNA 的ITS 序列。

PCR 反应体系（50 μL）：DNA 2 μL、ITS4 和ITS5 各1.5 μL、Mixs 25 μL、ddH2O 20 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s；56 ℃退火40 s；72 ℃延伸1 min；共35 个循环；72 ℃终延伸10 min；4 ℃保温。PCR 产物电泳检测及测序：把提取的DNA进行PCR 扩增，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，后将PCR产物送至擎科生物技术公司进行测序，将ITS 数据序列通过NCBI 数据库进行BLAST比对，确定菌株分类地位。

1.3 内生真菌促生功能筛选

1.3.1 分泌吲哚乙酸（IAA）能力测定 ①定性分析：采用Salkowski 比色法[27]，将菌株分别接种到含诱导物色氨酸和不含色氨酸的Kings B培养液中，于28 ℃摇床培养7 d 进行液体发酵，设3 次重复，取2 mL发酵液，12 000 r ·min-1离心15 min，取1 mL上清液置于离心管中，加入等量氯化铁比色液，于暗处静置30 min，观察其颜色是否出现变化以及颜色的变化情况。

② 定量分析：以标品IAA 配制0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 mg·L-1的吲哚乙酸标准液，按上述显色方法，使用紫外分光光度计在530 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，计算出标准曲线方程，将①中的显色菌株置于紫外分光光度计波长530 nm处测OD值，代入方程中计算出菌株产吲哚乙酸的量。

1.3.2 产铁载体能力测定采用MAS-CAS 检测法[28]，将待测菌株的菌丝接种于CAS 琼脂培养基上，在黑暗条件下28 ℃培养7 d。通过观察CAS琼脂上真菌菌落周围的颜色变化来确定是否具有产载体能力，菌落在平板有橙黄色带包围的认为是产铁载体的菌株。以未接种的CAS为对照，每株菌测3个重复。

1.3.3 溶磷解钾能力测定 （1）溶磷。①定性检测：将待测菌株用打孔器（d=5 mm）截取菌饼接种至无机磷培养基（NPA）和蒙金娜有机磷培养基上，每个菌株设置3 次重复，置于26 ℃恒温培养7 d。根据溶磷圈直径与菌落直径的比值（D/d）大小定性判断该菌株是否具有溶磷能力。

②定量测定：采用钼锑抗比色法[29]测定培养液中有效磷含量。用打孔器（d=5 mm）截取菌饼接种至蒙金娜液体培养基中，每个处理组设置3次重复，置于28 ℃恒温摇床、150 r · min-1振荡培养7 d，将培养液于10 000 r ·min-1离心15 min，用紫外分光光度计在880 nm 处比色并测定OD 值，以此判断菌株对有机磷的溶解能力，绘制标准曲线，以标准曲线计算菌株有效磷含量。有效磷含量计算公式如下：

AP=（P×V×Ts）/V0。

式中：P为标准曲线中查的磷浓度；V为显色时定容体积；Ts分取倍数；V0为测定发酵液的体积；AP为有效磷含量。

（2）解钾。将待测菌株接种至解钾培养基上，3次重复。置于恒温培养箱26 ℃培养7 d，观察菌落周边是否会形成透明圈，将透明圈作为参考指标筛选出具有解钾活性的菌株。

1.3.4 固氮能力测定 将活化好的待测菌株接种于阿须贝氏（Ashby）培养基上，置于恒温培养箱28 ℃培养7 d，连续继代培养3 次，若菌株在Ashby培养基上正常生长，则表明该菌株具有固氮活性。

1.4 内生真菌对组培苗的促生作用

将苹果组培苗（红富士）培养7 d 观察无污染后，用打孔器打取5 mm×5 mm的菌饼接种于组培苗根部，每一株苗3 块菌饼，设5 个重复，以空白组培苗为对照。在组培瓶中培养50 d 后取苹果组培苗根、茎、叶，用自来水冲洗干净，置于20% KOH 水溶液中90 ℃水浴10～30 min，蒸馏水冲洗数次后用5%醋酸进行酸化，再滴加入墨水染色5～10 min，用清水脱色后即可镜检。同时对苹果组培苗进行生长指标测定，用直尺测量组培苗的株高及根长；采用叶绿素测定仪测定组培苗叶绿素和叶总氮含量。

1.5 数据分析

采用Photoshop、Excel 软件对数据进行图表处理，采用SPSS 26.0 软件对不同处理间的差异进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 内生真菌分离鉴定

对15 年生红富士苹果树的根、枝、叶，采用PDA、LB、孟加拉红3 种培养基进行内生真菌的分离，共分离获得87 株内生真菌。通过形态学初步鉴定后选取51 株真菌进行分子生物学鉴定。将51 株真菌归类为1 门4 纲8 目16 科21 属29 种，比对相似度均在97%以上。其中菌株LJ03、LJ08 与已知菌种的相似度低于90%，疑为新种（表1）。

其中，PDA 培养基上共分离出13 株，鉴定为9属10 种，占分离鉴定的26%；LB 上共分离出16 株，鉴定为7 属9 种

加色氨酸的菌株PG06 分泌IAA能力最强，分泌量高达（90.85±2.77）μg·mL-1，与其他菌株存在显著性差异（p＜0.05），其次是菌株PJ09，分泌量（26.55±3.26）μg·mL-1，菌株MJ10 分泌IAA 能力最弱，分泌量（14.62±1.69）μg·mL-1。不加色氨酸的菌株MJ09产IAA 分泌量最高，为（13.17±1.56）μg ·mL-1，其次是菌株PJ09，分泌量（12.47±2.31）μg·mL-1。最低是菌株PY03，分泌量只有（6.55±0.04）μg·mL-1。其中，含色氨酸分泌量最高的菌株来源于根部，不含色氨酸分泌量最高的菌株来源于枝部。枝部菌株PJ09不论是在含色氨酸或不含色氨酸中都呈现了较高的分泌量（图1）。

2.2.2 产铁载体能力测定 将菌株接种于CAS 培养基上，培养后观察菌落在平板上是否有橙黄色带包围，有则认为菌株具产铁载体能力（图2）。29 株内生菌中10 株具有产铁载体的能力。其中，菌株PJ09、MJ10、MJ01、MJ03、MJ07、LJ03 来源于枝部，菌株LG06、LG12 来源于根部，菌株PY10、LY03 来源于叶部。

2.2.3 溶磷解钾能力测定 对内生真菌进行有机磷和无机磷的定性测定，没有检测到溶无机磷功能的菌株，其中有3 株内生真菌能在有机磷培养基上形成透明溶磷圈（图3），D/d 比值范围在1.21～1.44。由于D/d 值的大小与菌株自身代谢产物酶种类、酸种类及其释放快慢等相关，因此为了避免误差，透明圈法只能作为溶磷菌的初步筛选指标，菌株需进一步进行液体发酵复筛，才能准确掌握溶磷能力的大小。

进一步用钼锑比色法判定菌株的解磷能力。根据公式计算得出菌株LG06 有效磷含量最高，达66.27 mg·mL-1，其次为PG10，磷含量20.01 mg·mL-1，菌株PG06含量最低只有3.30 mg·mL（-1 表2）。依据有效磷含量可判断菌株LG06 溶磷能力最强。在对29 株内生真菌解钾功能检测中，并未检测到其解钾能力。

2.2.4 固氮能力测定 将29 株内生真菌接种于无氮Ashby 固体培养基上。有26 株内生真菌能正常生长且生长状况良好，表明这26 株内生真菌具有固氮能力，其中PJ08 和PY03 在菌株边缘形成了透明圈，这表示菌株还可分解Ashby 培养基内的难溶化合物CaCO3 （图4）。

2.2.5 内生真菌对苹果组培苗的促生验证 依据IAA分泌量选取LG06、LG12、PG06、PJ09、LY09 共5株内生真菌进行组培苗回接实验。在组培瓶里培养50 d，回接菌株PJ09 的组培苗全部死亡，其余均可正常生长。其中，回接PG06 和LG12 菌株的组培苗成活率达100%，LG06 成活率为60%，LY09 成活率为40%。在定殖检测中，显微镜下可在苹果根的韧皮部观察到内生真菌，菌丝进入根表皮层，并沿纵轴延伸，具有可见的细胞间菌丝体形态，这表明菌株均在组培苗中定殖成功（图5）。

对回接处理的苹果组培苗进行生长指标的测定。结果表明与CK 相比，处理组叶片数量、叶绿素、叶片总氮含量存在显著差异（p＜0.05），而株高和根长无显著性差异。处理菌株LY09 株高值最高，较对照提高了46.31%，LG06 根长值最大，较对照提高了67.77%。菌株PG06 叶片数量、叶绿素含量、叶片总氮含量较对照差异最为显著，依次增加了61.17%、44.08%、42.56%；其次为菌株LG12，叶绿素含量、叶片总氮含量较对照增加了42.92%、40.67%。这表明IAA 分泌量高的苹果促生内生真菌可以增加苹果的叶绿素含量，而叶绿素含量的增加会增强苹果的光合作用，进而促进组培苗的生长（图6、表3）。

3 讨论

笔者在本研究中对苹果植株内生真菌进行促生功能研究，共分离获得内生真菌51 株鉴定为29种。研究结果表明，孟加拉红培养基分离获得的苹果内生真菌种类多于PDA培养基，这与徐涛[30]的结果一致；不同组织部位分离的结果显示，苹果枝部获得内生真菌种类最多，王万周[31]也曾证明苹果枝部可培养内生真菌种类比根和叶部更丰富。本研究根部获得的优势属为丛赤壳科的Dactylonectria 属，而邓振山等[19]从红富士根部分离得到的优势属为链格孢属（Alternaria），这可能与分离的季节、树龄或栽培区域有关。但徐涛[30]、李芳等[32]、王亚红等[33]从苹果枝条获得的枝孢属（Cladosporium）、间座壳属（Diaporthe）、黑孢属（Nigrospora）、毛壳菌属（Chaetomium）、节菱孢属（Arthrinium）等都与本文菌属一致，这表明相同的植物宿主中内生真菌的种类存在相似性。

IAA 是刺激细胞分裂、促进植物根系形成和增加生长量的植物激素。本次实验中筛选的内生真菌，含色氨酸时各菌株产IAA 的量在14.62～90.85 μg ·mL-1；不含色氨酸時各菌株产IAA的量在6.55～13.17 μg·mL-1。在植物中，吲哚乙酸可由色氨酸前体（TRP）通过各种途径产生，多数研究者证明色氨酸介导下更适合IAA 的产生与合成[34-36]。Shah等[37]对铁皮石斛内生真菌研究表明所有菌株都能合成IAA，在添加色氨酸后菌株R10 产IAA 量接近60 μg ·mL-1。在乔木中，闽楠内生真菌加色氨酸后IAA 含量最高达41.39 μg · mL- 1 [27]，杜仲内生真菌IAA 含量最高达38 mg·mL-1 [38]，本研究苹果内生真菌加色氨酸后IAA 分泌量最高达90.85 μg·mL-1，处于相对较高的水平。

铁载体是可以螯合土壤中游离铁的低分子量化合物，是微生物代谢的重要分子，可以作为各种酶的辅助因子，抑制病原微生物的生长，促进植物生长。本研究中筛选出具有产生铁载体能力的内生真菌10 株，其中间座壳属（Diaporthe）有3 株都具有产铁能力，菊芋内生真菌的间座壳属菌株也表明具有产铁载体能力[12]。菌株PJ09 为链格孢属（Alternaria），Turbat 等[15]从苦参内生真菌中也筛选到链格孢属菌株具有产铁能力。菌株MJ01 为青霉属（Penicillium），冯美茹[23]在百花曼陀内生真菌中筛选到青霉属具有产铁能力。另5 株分别为LG06 Dactylonectriaalcacerensis、LG12 球毛壳菌（Chaetomium globosum）、PY10 Neosetophoma rosigena、LY03 Anastomitrabeculiadidymospora、MJ03 巴西拟隐盘孢菌（Paraconiothyrium brasiliense），尚没有关于其产铁载体能力的报道。

本次實验中并未筛选到溶解无机磷能力的菌株，但从根部筛选到3 株具有溶解有机磷能力的菌株。其中LG06 Dactylonectria alcacerensis 解有机磷能力达66.27 mg·mL-1，其次为PG10 Thelonectriablackeriella 达20.01 mg·mL-1。马韦韦[39]对野生延胡索内生真菌进行解有机磷能力筛选，发现其内生真菌简青霉（Penicillium asturianum）和米曲霉（Aspergillusoryzae）有解有机磷能力。徐润冰[40]发现植物内生真菌H88-2c（Argyranthemum apiacea）具有解有机磷能力，且高达134.40 mg·L-1，本次筛选出的菌株与其相比解有机磷能力较低。

植物内生固氮菌是指定殖在植物内部与宿主联合固氮的菌，是植物内生菌中最受关注的类群之一[41]。对于内生固氮菌种类的研究目前主要集中于细菌，内生真菌的固氮能力还有待探索。冯美茹[23]对百花曼陀罗内生真菌的固氮研究发现，其分离的全部菌株都可在阿须贝氏培养基上正常生长。在本研究中共有29 株内生真菌，有26 株可在无氮培养基上正常生长。可见植物内生真菌也是开发固氮内生菌不容忽视的重要菌源。

为了进一步探究苹果内生真菌与苗木间的互利共生关系，选取IAA 含量高、兼具促生功能多的菌株回接至苹果组培苗，观察其对组培苗的生长影响。结果表明除PJ09 菌株外其余4 株内生真菌对苹果组培苗的促生效果明显。其中，菌株LG06 分离率达21%，是较有优势的苹果内生真菌，同时兼具有产IAA、铁载体、固氮和溶解有机磷能力，显示出了良好的促生潜力，回接苹果组培苗后也表现出明显的生长优势。菌株PG06 为粉红粘帚霉（Clonostachysrosea f. catenulata），分泌IAA 能力最强，分泌量达（90.85±2.77）μg·mL-1，同时兼具2 种促生特性。粉红粘帚霉作为一种重要的植物内生真菌，因其具有强大的破坏力，成为很多植物病原真菌的克星，如葡萄孢菌、草莓灰霉菌等，是目前极具潜力的生防菌之一[42]。菌株LG12 为球毛壳菌（Chaetomiumglobosum），可产IAA、铁载体和固氮。该属广泛分布于空气、土壤等多种自然环境中，也是植物最常见的内生真菌之一。球毛壳菌能产生种类繁多的次级代谢产物，且其次级代谢产物具有抗真菌和杀线虫等多种生物活性，对植物病原真菌和根结线虫（Meloidogyne spp.）有较大的生物防治潜力[43]。

以上菌株丰富了苹果内生促生菌资源，为开发苹果内生真菌生物菌肥提供了理论基础与科学依据。以上菌株的内生真菌的次级代谢产物、多样性及生物防治功能筛选等，将是未来进一步研究的重点。

4 结论

从苹果植株根、枝、叶分离获得内生真菌51 株鉴定为29 种。对促生潜力筛选发现，29 株菌均有不同程度的产IAA能力，10 株具有产铁载体功能，3 株具有解有机磷能力，26 株具有固氮能力，29 株均不具有解钾能力。选取IAA 含量高、兼具促生功能多的5 株菌回接苹果组培苗，结果表明，内生真菌PG06、LG12、LG06、LY09 对组培苗均具有显著促生作用。

致谢：感谢中国农业科学院果树研究所董雅凤老师为本试验提供苹果组培苗。

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