Wnt5a对肝星状细胞增殖、迁移和衰老的调控作用

曹雨萌,张荣花,刘雨潭,张亚楠,赵 丹,黄金平,张 政,章广玲,李景武

0 引 言

肝纤维化可由多种因素引发,包括饮酒、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎和胆汁淤积综合征［1］。肝纤维化是一种细胞外基质积累,导致纤维瘢痕形成的生理病理过程［2］。肝星状细胞(hepatic stellate cells ,HSCs)是肝纤维化发生发展中的关键细胞,其活化受细胞因子和细胞内信号转导途径的调控,因此其活化过程中的相关调控因子是抗肝纤维化治疗的重要靶标。

Wnt家族蛋白5a(Wnt5a)是Wnt基因家族中的成员之一。Wnt5a基因定位在染色体3p14-p21上,由5个外显子组成,最后一个外显子跨越约6.5千个碱基对的3′-非翻译区,包含多个聚腺苷酸化位点［3］。近年来,Wnt5a被证实在多种组织的纤维化中发挥着重要作用,如Wnt5a通过诱导转录调节因子YAP/TAZ表达进而促进TGF-β1介导的巨噬细胞极化和肾脏纤维化［4］。Wnt5a和Wnt11通过FZD5和EGFR信号的串扰促进压力超负荷下的心脏纤维化［5］。有报道称,气道平滑肌细胞中Wnt5a的过表达导致肺部纤维化病灶的数量增加、胶原沉积增多和肺组织硬度增强,从而导致肺部纤维化程度加重［6］。然而,Wnt5a在肝纤维化中的潜在调节机制尚未阐明,所以探讨Wnt5a在肝中的作用机制显得尤为关键。

1 材料与方法

1.1 材料人肝星状细胞购自武汉普诺赛生物科技有限公司(CL-0560)。DMEM培养基及DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清(FBS)购自美国BI公司;青霉素链霉素双抗(PS)、胰酶均购自美国Gibco公司;转化生长因子β1(TGF-β1)和表皮生长因子(EGF)均购自美国Peprotech公司;lip2000购自美国Invitrogen公司;si-Wnt5a序列设计及合成由安徽通用生物有限公司完成;CCK-8试剂盒购自北京庄盟生物基因有限公司;细胞衰老β-半乳糖苷酶试剂盒购自上海碧云天有限公司;Trizol总RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司;逆转录及实时荧光定量PCR试剂盒购自北京聚合美生物技术公司;GAPDH(37000)、α-SMA(45000)、COL1A1(129000)均购自天津赛尔生物技术有限公司;Wnt5a(45000)购自沈阳万类生物技术公司;DAPI购自上海碧云天有限公司。10×电泳缓冲液、10×蛋白电转缓冲液、10×封闭-洗涤缓冲液(TBST)、ECL发光液、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均购自北京普利莱基因技术有限公司。

1.2胆总管结扎BDL大鼠模型芯片制备课题组已建立利用胆总管结扎的方法诱导胆汁淤积性肝纤维化大鼠模型,造模14 d后分别取BDL组和假手术组(Sham组)大鼠肝组织进行mRNAs表达谱芯片分析(北京博奥经典生物技术有限公司)［7］。

1.3细胞培养将LX-2细胞从液氮中取出复苏,LX-2细胞接种于4 mL含10% FBS的完全培养基(10% FBS+1% PS+DMEM)细胞培养瓶中,放置于37 ℃,5% CO2恒温培养箱中培养,2～3 d传代。

1.4TGF-β1活化LX-2细胞取处于对数生长期的LX-2细胞,胰酶消化,分3组,按照3×105个/孔细胞数量接种于6孔板。共分3组:NC组只加入完全培养基,5 μg/L TGF-β1处理组加入含5 μg/L的TGF-β1完全培养液,10 μg/L TGF-β1处理组加入含10 μg/L的TGF-β1完全培养液。置于37℃,5% CO2细胞专用培养箱培养24～48 h。之后提取细胞的RNA及蛋白检测活化标志物的表达。

1.5qRT-PCR检测α-SMA、COL1A1、Wnt5a mRNA表达采用Trizol法提取细胞总RNA,通过Nanodrop测定RNA的质量和浓度,使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA,之后根据说明书使用实时荧光定量PCR系统进行检测,引物由上海生工合成,序列见表1,反应程序如下:两步法PCR扩增标准程序:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s,40个循环;60 ℃,34 s。以GAPDH作为内参,实验重复3次,使用2-ΔΔct计算基因相对表达量。

1.6Westernblot检测α-SMA、COL1A1、Wnt5a蛋白表达细胞转染48 h后,提取总蛋白,使用BCA检测试剂盒测定细胞蛋白浓度,之后进行蛋白变性。变性后按照每孔15 μg总蛋白上样,进行SDS-PAGE电泳、转膜,室温封闭2 h,然后对应抗体4 ℃过夜。第2天二抗孵育2 h后,ECL显色,拍照后通过ImageJ软件分析条带灰度值。

1.7细胞转染取对数生长期的细胞进行转染,分为si-NC组、si-Wnt5a-1组、si-Wnt5a-2组、si-Wnt5a-3组,各组转染步骤参照lip2000说明书,转染siRNA终浓度为20 nmol/L。转染4～6 h后换无双抗含血清的培养液用于后续实验。

1.8免疫荧光检测α-SMA和Wnt5a的表达将转染后的各组细胞接种于小皿,利用4%多聚甲醛固定30 min后进行打孔,用5% BSA封闭1 h后参照一抗的说明书孵育一抗,第2天加入二抗继续孵育,移除二抗后加入3～4滴DAPI进行染核,最后加入抗荧光淬灭剂封片,在倒置显微镜下进行荧光采集操作。

1.9CCK-8检测细胞增殖能力取转染24 h后的细胞,胰酶消化后,以2×103个/孔接种于96孔板,每组设置3个复孔。在37 ℃,5% CO2培养箱中培养96 h,每24 h在对应的孔中加入CCK-8溶液(每孔10 μL CCK-8试剂+100 μL培养液)。孵育2 h后,酶标仪测定450 nm波长下的吸光度值。

1.10集落形成实验将转染后的各组细胞以3×103个/孔接种于6孔板,每组设3个复孔,在培养箱中进行培养。培养过程中每3天补加一次新鲜培养液,在倒置显微镜下观察细胞克隆形成的情况。选取细胞数≥50个的集落作为计数的对象,结晶紫染色细胞,光线好处拍照。

1.11Transwell实验将转染后的各组细胞以2×104个/孔接种于Transwell上层小室,上室使用的是无血清培养基。下层小室加入650 μL含20% FBS的DMEM培养基,置于培养箱中培养24 h。次日,用镊子夹出上层小室,吸净上层小室的培养液,等渗盐水洗3遍,棉签轻拭上层小室。结晶紫染色5～10 min,等渗盐水洗3遍。显微镜下随机选取视野进行拍照,利用Image J软件计数各组细胞迁移数,计算穿膜细胞数量平均值。

1.12划痕实验将LX-2细胞按照1.5×105个/孔接种于6孔板中,当细胞密度50%进行转染,转染换液24 h后,用10 μL枪头在孔内均匀划直线,PBS清洗细胞碎片,加入无血清的培养基后扫图拍照,随后置于培养箱中继续培养。24、48 h在显微镜下观察细胞迁移状态,并拍照。利用Image J软件计算各组细胞迁移面积,计算迁移率(划痕面积用ImageJ软件测量),公式如下:

迁移率=(0 h划痕面积-24/48 h划痕面积)/0 h划痕面积×100%

1.13β-半乳糖苷酶染色实验将转染后48 h的各组细胞按照试剂盒说明书进行染色,37 ℃过夜后,显微镜下观察阳性细胞数并拍照。

1.14京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集和基因本体(GO)分析将miRNAs和靶基因在Metascape(https://metascape.org/)进行GO与KEGG分析。

1.15生物信息学筛选靶基因miRDB、Starbase、TargetScan数据库预测与Wnt5a有靶向关系的miRNAs。

2 结 果

2.1 筛选差异表达的miRNAs课题组前期利用胆总管结扎(BDL)的方法诱导胆汁淤积性肝纤维化大鼠模型,并对肝组织切片进行HE、Masson’s trichrome、Sirius red和免疫组化等组织学分析确定BDL大鼠模型构建成功［7］。然后通过基因芯片技术比较BDL组和Sham组大鼠肝mRNAs的表达谱并制作火山图,分析结果显示,Wnt5a是表达上调显著的基因之一,见图1。

2.2TGF-β1活化LX-2细胞通过qRT-PCR和Western blot实验分别检测TGF-β1处理后LX-2细胞活化标志物α-SMA、COL1A1 mRNA和蛋白表达水平的变化,与对照组相比,5 μg/L TGF-β1处理的LX-2细胞中α-SMA和COL1A1 mRNA和蛋白的表达水平升高差异无统计学意义(均P>0.05),10 μg/L TGF-β1处理的LX-2细胞中α-SMA和COL1A1 mRNA和蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),提示TGF-β1能够活化LX-2细胞。见图2、图3。

图 1 BDL大鼠肝组织中基因表达火山图

1:NC组;2:5 μg/L TGF-β1处理组;3:10 μg/L TGF-β1处理组

2.3Wnt5a在TGF-β1活化的LX-2细胞中表达上调qRT-PCR和Western blot检测活化的LX-2细胞中Wnt5a的表达水平。结果表明,与对照组相比,5 μg/L TGF-β1处理的LX-2细胞中Wnt5a mRNA和蛋白的相对表达水平升高差异无统计学意义(P>0.05),10 μg/L TGF-β1处理的LX-2细胞中Wnt5a mRNA(8.17±0.90)和蛋白(1.29±0.03)的相对表达水平显著升高(P<0.05),见图4。通过免疫荧光实验技术检测TGF-β1活化的LX-2细胞中α-SMA和Wnt5a的表达,与对照组相比,在10 μg/LTGF-β1处理的LX-2细胞中α-SMA和Wnt5a高表达,同时,由TGF-β1激活的LX-2细胞的双重免疫荧光染色显示Wnt5a和肝纤维化标记物α-SMA紧密共定位,见图5。提示Wnt5a在TGF-β1活化的LX-2细胞中表达上调。

1:NC组;2:5 μg/L TGF-β1处理组;3:10 μg/L TGF-β1处理组

1:NC组;2:5 μg/L TGF-β1处理组;3:10 μg/L TGF-β1处理组

图 5 免疫荧光检测TGF-β1处理LX-2细胞后α-SMA和Wnt5a的表达(免疫荧光染色×200)

2.4转染si-Wnt5a后Wnt5a的表达下降实验分为对照si-NC组、si-Wnt5a-1组、si-Wnt5a-2组、si-Wnt5a-3组。qRT-PCR和Western blot分别检测各组LX-2细胞中Wnt5a mRNA和蛋白的表达水平,见图6。结果显示,与si-NC组相比, si-Wnt5a-1组中Wnt5a mRNA(0.37±0.21)、si-Wnt5a-2组中Wnt5a mRNA(0.32±0.05)、si-Wnt5a-3组中Wnt5a mRNA(0.16±0.07)的相对表达水平均降低(P<0. 01),si-Wnt5a-1组中Wnt5a蛋白(0.77±0.06)的相对表达水平降低差异无统计学意义(P>0.05),si-Wnt5a-2组Wnt5a蛋白(0.71±0.16)、si-Wnt5a-3组Wnt5a蛋白(0.71±0.10)的相对表达水平降低差异有统计学意义(P<0.05)。因此si-Wnt5a-2组、si-Wnt5a-3组作为后续实验的转染组。

1:si-NC组;2:si-Wnt5a-1组;3:si-Wnt5a-2组;4:si-Wnt5a-3组

2.5si-Wnt5a抑制LX-2细胞中α-SMA和COL1A1表达通过qRT-PCR和Western Blot分别检测在si-Wnt5a-2,si-Wnt5a-3处理LX-2细胞后α-SMA和COL1A1 mRNA和蛋白表达水平的改变。与si-NC-2组相比在si-Wnt5a-2处理的LX-2细胞中α-SMA、COL1A1 mRNA和蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),见图7。与si-NC-3组相比在si-Wnt5a-3处理的LX-2细胞中α-SMA、COL1A1 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),见图8。综上,结果表明si-Wnt5a抑制LX-2细胞中α-SMA和COL1A1的表达,从而抑制LX-2细胞的活化。

1:si-NC-2组;2:si-Wnt5a-2组

1:si-NC-3组;2:si-Wnt5a-3组

2.6si-Wnt5a抑制LX-2细胞增殖能力通过CCK-8实验检测各组LX-2细胞的增殖情况。与各自对照组相比,si-Wnt5a-2组,si-Wnt5a-3组LX-2细胞的增殖能力受到抑制,增殖活性差异均具有统计学意义(P<0.05)。结果表明敲降Wnt5a后可有效抑制LX-2细胞增殖能力。见图9。

2.7si-Wnt5a抑制LX-2细胞集落形成能力通过集落形成实验观察各组LX-2细胞集落形成情况,与各自对照组相比,si-Wnt5a-2,si-Wnt5a-3组细胞相对集落形成率［(0.77±0.06)%、(0.80±0.06)%］都明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。表明提示敲降Wnt5a后可以抑制LX-2细胞的集落形成能力。见图10。

与si-NC组相比,*P<0.05、**P<0.01

图 10 集落形成实验检测si-Wnt5a-2、si-Wnt5a-3对LX-2细胞集落形成能力的影响

2.8si-Wnt5a抑制LX-2细胞迁移能力Transwell实验检测各组LX-2细胞的迁移数量。与对照组(141.70±7.02)相比,si-Wnt5a-2组,si-Wnt5a-3组穿过上层小室的细胞数量(89.33±9.02、114.70±5.86)明显减少,LX-2细胞的迁移能力受到了抑制,且差异均具有统计学意义(P<0.01),见图11。划痕实验检测各组LX-2细胞的迁移面积,与各自对照组相比,划痕24 h和48 h后,si-Wnt5a-2组相对迁移面积(34.20±1.71、66.11±1.31)及si-Wnt5a-3组相对迁移面积(35.90±1.70、79.72±2.22)明显减少,且差异具有统计学意义(P<0.05),见图12。这些结果表明敲降Wnt5a后可有效抑制LX-2细胞迁移数量和迁移面积。

图 11 Transwell实验检测si-Wnt5a-2、si-Wnt5a-3对LX-2细胞迁移数量的影响(结晶紫染色 ×50)

图 12 划痕实验检测si-Wnt5a-2、si-Wnt5a-3对LX-2细胞迁移面积的影响( ×20)

2.9si-Wnt5a促进LX-2细胞衰老细胞衰老β-半乳糖苷酶实验(SA-β-gal染色)检测LX-2细胞的衰老情况。结果显示,与对照组(20.24±2.46)相比,si-Wnt5a-2组和si-Wnt5a-3组蓝色阳性细胞数(35.34±3.61、28.50±2.67)较多,即细胞衰老程度更高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结果表明敲降Wnt5a可促进LX-2细胞衰老。见图13。

图 13 SA-β-gal染色检测si-Wnt5a-2和si-Wnt5a-3对LX-2细胞衰老的影响(SA-β-gal染色 ×50)

2.10Wnt5a的蛋白互作网络及GO和KEGG富集分析利用STRIGN网站和Cytoscype软件构建Wnt5a的蛋白互作网络,有10个蛋白与其关系密切,见图14a。10个蛋白基因的GO和KEGG富集分析,主要富集在经典Wnt信号通路和Wnt信号通路中,见图14b。

a:Wnt5a的蛋白互作网络图;b:10个蛋白的GO和KEGG分析

2.11预测与Wnt5a有靶向关系的miRNAs利用生物信息学网站miRDB(http://www.mirdb.org/)、Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)、TargetScan(https://www.targetscan.org/)预测与Wnt5a具有靶定关系的miRNAs,三个数据库中预测出共同的miRNAs共34个,见图15a。对这34个miRNAs进行GO和KEGG富集分析,见图15b。

a:通过生物信息学网站预测与Wnt5a有靶向关系的miRNAs;b:34个miRNAs的GO和KEGG分析

3 讨 论

肝纤维化是以细胞外基质沉积为特征的创伤愈合过程,在这一过程中肝星状细胞是肝纤维化发生发展中的关键细胞。近年来研究表明去除致病源不再是抑制纤维化发展的唯一方法,诱导HSCs的凋亡也能阻止肝纤维化的恶化发展［8］。HSCs不仅在肝脏的生长、分化及免疫调节中起着重要的作用,而且在各种肝疾病的发生过程中也扮演着重要的角色［9-10］。HSCs是一种活化的肌成纤维细胞,是细胞外基质的主要来源［11-12］。静止状态HSCs主要功能是储存视黄醇(维生素A)的脂滴。当肝脏损伤时,静息的肝星状细胞就会被多种细胞分泌因子激活［13-14］。TGF-β(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)是肝中最有效的促纤维化细胞因子,具有调节细胞外基质结构和功能的作用［15］。活化的肝星状细胞就会分泌多种细胞外基质且抑制细胞外基质的降解,导致细胞外基质的沉积,形成肝纤维化［16-17］。为此HSCs作为潜在的治疗目标和预防肝纤维化及肝细胞癌发生的研究受到越来越多的关注［18］。

大多数Wnt蛋白的大小在38 000到43 000之间,它们含有多达22个保守的半胱氨酸残基,并且有显著的糖基化和脂质修饰。WNT蛋白分为激活β-catenin(典型)途径的经典WNTs和诱导β-catenin非依赖(非典型)途径的非经典WNTs［19］。Wnt信号通路是一种进化上保守的细胞间通讯系统,在成人胚胎发育过程中的炎症反应、细胞增殖、分化以及组织内稳态等方面发挥着重要作用［20-21］。导致Wnt信号级联低水平或高水平激活的药理学机制或基因突变也与一系列人类疾病有关,包括糖尿病肾病(DN)、肾纤维化、胰腺癌、前列腺癌和支气管哮喘等［22］。Wnt5a还参与乳腺发育和乳腺导管延伸和分支的抑制［23］。Wnt5a对前列腺癌［24］、黑色素瘤［25］和胃癌［26］具有促肿瘤作用,Wnt5a的促肿瘤活性还影响多个细胞过程,包括增殖、分化、血管生成、化疗耐药、迁移、侵袭、上皮-间充质转化(EMT)和转移［27-28］。由于Wnt信号基于肝纤维化的机制研究结果还未被广泛研究,本实验则证实了Wnt非经典信号通路中Wnt5a成员与肝星状细胞的相互作用关系。

本研究首先通过芯片分析肝纤维化模型大鼠中mRNAs的表达谱,Wnt5a是上调表达显著的基因之一。然后通过qRT-PCR和Western Blot检测TGF-β1处理的LX-2中Wnt5a的表达水平,在活化的LX-2中Wnt5a高表达,猜测其差异表达可能与肝纤维化相关,接下来探究Wnt5a对LX-2细胞生物学功能的影响。当敲降LX-2细胞中Wnt5a的表达后,结果显示LX-2细胞的增殖、迁移、集落形成能力受到抑制,衰老的细胞增多,肝纤维化活化标志物α-SMA和COL1A1 mRNA和蛋白的表达受到抑制,因此,Wnt5a具有促纤维化的作用。但是具体机制引起本课题组进一步思考,故对Wnt5a利用STRIGN网站和Cytoscype软件构建了其蛋白互作网络并通过生物信息学网站预测了与其有靶向关系的miRNAs,对分析得出的蛋白及miRNAs又进一步进行了GO和KEGG富集分析,希望进一步通过Wnt5a寻找其上下游Wnt通路中多种因子对肝纤维化的影响,以及通过体内实验探究Wnt5a的差异表达对肝纤维化中的炎症反应、血管生成等过程的影响,从而阐明完整的调控信号网络。