基于化学发光法的凤头姜仔姜与老姜醇溶黄酮的抗氧化能力比较

燕品睿　寇德正　周贵华　李伟　程超

摘要：文章以凤头姜仔姜和老姜为实验材料，利用乙醇萃取反复沉淀的方法制备凤头姜仔姜、老姜醇溶黄酮，采用化学发光法构建了超氧阴离子自由基（O2-·）、羟自由基（·OH）、H2O2和对DNA损伤的保护作用4种抗氧化体系，分别测定凤头姜仔姜、老姜醇溶黄酮在4种不同抗氧化体系中的抗氧化能力。结果显示，凤头姜仔姜、老姜清除O2-·的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分别为（26.761 3±0.416 8），（31.108 3±0.337 0） μg/mL；清除·OH的IC50分别为（4.276 3±0.889 8），（14.395 0±0.969 6） μg/mL；清除H2O2的IC50分别为（0.172 3±0.002 1），（0.172 0±0.004 4） μg/mL；对DNA损伤保护的IC50分别为（6.832 0±1.020 6），（8.547 0±0.461 6） μg/mL。T检验发现凤头姜仔姜醇溶黄酮的抗氧化能力显著强于老姜，但在过氧化氢体系中，凤头姜仔姜的抗氧化能力与老姜无显著差异。

关键词：凤头姜仔姜；凤头姜老姜；醇溶黄酮；化学发光法；抗氧化

中图分类号：TS201.2文献标志码：A 文章编号：1000-9973（2023）06-0053-06

Abstract： In this paper， with tender and old Fengtou ginger as the experimental material， the alcohol-soluble flavonoids of tender and old Fengtou ginger are prepared by ethanol extraction and repeated precipitation. Four antioxidation systems including superoxide anion free radical （O2-·）， hydroxyl free radical （·OH）， H2O2 and the protection effect of DNA damage are established by chemiluminescence method. The antioxidant capacity of alcohol-soluble flavonoids of tender and old Fengtou ginger in the four different antioxidant systems is determined respectively. The results show that the half maximal inhibitory concentration （IC50） of tender and old Fengtou ginger on scavenging O2-· is （26.761 3±0.416 8），（31.108 3±0.337 0） μg/mL; the IC50 on scavenging ·OH is （4.276 3±0.889 8），（14.395 0±0.969 6） μg/mL; the IC50 on scavenging H2O2 is （0.172 3±0.002 1），（0.172 0±0.004 4） μg/mL; the IC50 on the protection of DNA damage is （6.832 0±1.020 6），（8.547 0±0.461 6） μg/mL. T test shows that the antioxidant capacity of tender Fengtou ginger alcohol-soluble flavonoids is significantly stronger than that of old ginger， but there is no significant difference between the antioxidant capacity of tender and old Fengtou ginger in hydrogen peroxide system.

Key words： tender Fengtou ginger; old Fengtou ginger; alcohol-soluble flavonoids; chemiluminescence method; antioxidation

收稿日期：2022-12-30

基金項目：国家重点研发计划项目（2018YFD0400104）；恩施州科技局计划项目（D20190023）

作者简介：燕品睿（1997—），男，硕士研究生，研究方向：生物资源开发利用。

*通信作者：程超（1976—），女，教授，博士，研究方向：食品化学及资源开发。

生姜（Zingiber officinale Roscoe）是姜属草本植物的新鲜根茎[1]，因其独特的风味在世界范围内被广泛种植，我国是生姜的主要发源地之一，具有两千多年的种植历史[2]。湖北省来凤县有五百余年的生姜种植历史，全县年产量约4 500万公斤，产量居全省之首。来凤县生姜形如凤凰头，因此俗称“凤头姜”，风味质构等品质独特。凤头姜仔姜无筋脆嫩、辛辣适中、美味可口、食用价值高，因此由仔姜加工而成的产品备受欢迎。

生姜营养成分丰富，新鲜生姜可溶性糖、淀粉、蛋白质含量分别为2.1%～5.3%、5.8%～7.9%、7.9%～10.1%；此外，生姜还含有黄酮、维生素及蛋白酶等多种特征成分，正是生姜中特征成分的存在才使其具有抗氧化、抗炎、抗癌、降血糖等多种生物活性[3]。在生姜特征成分中，黄酮含量高达0.75%。现已证明黄酮具有一定的抗氧化活性[4]，但不同黄酮的抗氧化能力有差异，主要影响因素有内因和外因两种，外因主要包括黄酮提取分离的系统溶剂，不同的系统溶剂导致萃取的黄酮结构、溶解性等有差异[5]，因此抗氧化效果随之变化。前期研究发现，乙醇提取的生姜黄酮溶液旋转浓缩低温静置后，分别生成两种不同的产物——上清液和结晶，分别命名为醇提水溶黄酮和醇溶黄酮，其中醇提水溶黄酮对超氧阴离子自由基、羟自由基、H2O2均具有较好的清除作用[6]。影响黄酮抗氧化效果的内因主要包括生姜自身所含的黄酮物质的种类，而影响内因的主要因素是生姜的品种和生长环境，刘步云等[7]发现，云南黄姜和永康黄姜的抗氧化和抗炎症效果要优于其他生姜。梅邢等[6]研究发现，凤头姜老姜的醇溶和水溶黄酮抗氧化效果较好，而人们喜食的凤头姜仔姜和老姜的黄酮抗氧化功能的差异目前还未见相关报道。

目前用于评价抗氧化能力的方法多种多样，如高效液相色谱法、分光光度法、化学发光法、电子自旋共振法、电化学法和荧光光谱法，其中化学发光法以其灵敏度高、仪器简单、操作方便等优点受到了广泛关注[8]。因此，本文以凤头姜仔姜、老姜为试材，采用醇提浓缩反复沉淀的方法制备凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮，利用化学发光法的4种抗氧化体系系统评价其抗氧化能力的差异，进而为凤头姜资源的深度开发提供理论资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

凤头姜仔姜（8月初采收）、凤头姜老姜（11月采收）：湖北省凤头食品有限公司。

1.1.2 主要试剂

氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、邻菲罗啉、碳酸钠、碳酸氢纳、抗坏血酸、硫酸铜、双氧水、邻苯三酚：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；芦丁：分析纯，上海西亚实业总公司；鲁米诺：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

RE-2000A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；GloMax-Multi Jr单管化学发光仪 美国Promega公司。

1.3 实验方法

1.3.1 凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮的提取方法

将凤头姜仔姜和老姜分别洗净沥干切块，榨汁取汁液并用尼龙布（200目）过滤，取滤液，于4 ℃静置24 h后取上清液，加入无水乙醇至终浓度达到80%，保持1 h，期间反复振摇3次，而后离心15 min得上清液（4 000 r/min），旋转浓缩至乙醇挥发，将浓缩液于4 ℃静置24 h，去上清液，取沉淀加蒸馏水混匀，于4 ℃再次静置24 h，如此反复处理3次，最后将结晶部分冷冻干燥，得凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮[5]。

1.3.2 凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮得率测定

芦丁标准曲线的制作方法：配制0.2 mg/mL芦丁标准溶液，分别取0，1，2，3，4，5，6 mL此标准溶液于25 mL容量瓶中，依次加入5% NaNO2溶液0.6 mL、10% Al（NO3）3溶液0.6 mL、4% NaOH溶液8 mL、60%乙醇定容，静置15 min后测定510 nm处的吸光度值，记为A510[6-9]，以A510为纵坐标、芦丁质量（mg）为横坐标绘制散点图，线性拟合后得回归方程y=0.439 0x－0.007 9，R2=0.999 2。

凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮含量测定：称取1.3.1制备的黄酮粉末，用60%乙醇溶解并定容至25 mL，移取1 mL，按芦丁标准曲线制作方法测定生姜黄酮溶液的A510，按式（1）计算黄酮含量：

C=A510+0.007 90.439×F。（1）

式中：C为黄酮含量（mg/mL）；F为稀释倍数。

1.3.3 凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮对O2-·的清除作用

在发光池中依次加入50 μL不同浓度的凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮溶液、鲁米诺和碳酸缓冲液混合物900 μL、6.25×10-4 mol/L邻苯三酚50 μL，反应温度30 ℃，连续测定 400 s发光强度，间隔2 s 记数，此为样品发光管（chemiluminescence intensity of sample，简写为CLs）。空白发光管（chemiluminescence intensity of blank，简写为CLb）用60%乙醇替换黄酮溶液，本底发光管（chemiluminescence intensity of background，简写为CLg）用重蒸水替换邻苯三酚溶液[10-13]。

1.3.4 凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮对·OH的清除作用

在发光池中依次加入50 μL不同浓度的凤头姜老姜和仔姜醇溶黄酮溶液、pH 9.0的0.05 mol/L 硼砂700 μL、1.0 mmol/L CuSO4 和1.0 mmol/L邻菲罗啉溶液各50 μL、1 mmol/L VC 100 μL、0.15% H2O2 50 μL，间隔3 s记数，记录400 s发光强度 [14-16]，此为样品发光管（CLs）。空白发光管（CLb）用60%乙醇替换黄酮溶液，本底发光管（CLg）用重蒸水替换H2O2溶液。

1.3.5 凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮对H2O2的清除作用

在发光池中依次加入50 μL不同浓度的凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮溶液、0.1 mmol/L鲁米诺溶液（用pH 7.4的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液配制）600 μL、0.4 mmol/L FeSO4 50 μL、1.5% H2O2 50 μL，反應温度30 ℃，间隔2 s记数，测定100 s发光强度[17]，此为样品发光管（CLs）。空白发光管（CLb）用60%乙醇替换黄酮溶液，本底发光管（CLg）用重蒸水替换H2O2溶液。

1.3.6 凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮对DNA损伤的保护作用

在发光池中依次加入100 μL不同浓度的凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮溶液、800 μL DNA-Cu2+-Phen溶液（用0.1 mol/L醋酸缓冲液配制，含有3 μg/mL DNA、7.5×10-5 mol/L CuSO4、5.25×10-4 mol/L Phen）、4.2×10-3 mol/L VC 100 μL、3% H2O2 200 μL，间隔3 s记数，记录800 s发光强度[18-20]，此为样品发光管（CLs）。空白发光管（CLb）用60%乙醇替换黄酮溶液，本底发光管（CLg）用重蒸水替换H2O2溶液。

1.3.7 凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮抗氧化数据统计分析

实验平行3次，结果以“平均值±标准偏差”表示。采用SPSS 25.0进行T检验，采用Excel 2010和Origin 2021绘图。按式（2）计算清除率（I）：

I（%）=CLb－CLsCLb－CLg×100。（2）

2 结果与分析

2.1 凤头姜老姜和仔姜醇溶黄酮对O2-·的清除作用

以60%乙醇为溶剂，配制0.35，0.56，0.7，0.92，1.4 mg/mL的凤头姜老姜醇溶黄酮溶液，0.18，0.36，0.72，0.96，1.46 mg/mL的凤头姜仔姜醇溶黄酮溶液，按照1.3.3实验方法测定其对O2-·的清除作用，结果见图1。

根据图1中a、b不同浓度凤头姜老姜、仔姜醇溶黄酮清除O2-·的发光强度曲线，按照式（2）计算不同质量浓度黄酮对O2-·的清除率，以清除率（y）为纵坐标、黄酮质量浓度（μg/mL）为横坐标（x）绘制剂量-效应关系图，见图1中c。生姜醇溶黄酮浓度越高，清除O2-·能力越强。此外，依据Excel拟合得凤头姜仔姜、老姜醇溶黄酮清除O2-·的回归方程，计算可得到凤头姜仔姜、老姜清除O2-·的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分别为（26.761 3±0.416 8），（31.108 3±0.337 0） μg/mL，IC50越小，说明黄酮对O2-·的清除能力越强，因此对比IC50可知凤头姜仔姜醇溶黄酮对O2-·的清除能力强于老姜。

2.2 凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮对·OH的清除作用

以60%乙醇为溶剂，配制0.04，0.22，0.34，0.44，0.68 mg/mL的凤头姜老姜醇溶黄酮溶液，0.03，0.06，0.10，0.20，0.34 mg/mL的凤头姜仔姜醇溶黄酮溶液，按照1.3.4实验方法测定其对·OH的清除作用，结果见图2。

按照测定凤头姜仔姜、老姜醇溶黄酮对·OH的清除效果的方法绘制对·OH清除能力的剂量效应关系图并拟合回归方程，见图2中c。两种生姜醇溶黄酮对·OH的清除能力符合幂函数关系，根据回归方程计算可得出凤头姜仔姜、老姜的IC50为（4.276 3±0.889 8），（14.395 0±0.969 6） μg/mL，由此可见凤头姜仔姜对·OH的清除能力强于老姜。

2.3 凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮对H2O2的清除作用

以60%乙醇为溶剂，配制1.35，3.00，4.50，6.00，10.50 μg/mL的凤头姜老姜醇溶黄酮溶液，0.15，1.50，3.00，6.00，7.50 μg/mL的凤头姜仔姜醇溶黄酮溶液，按照1.3.5实验方法测定不同生姜醇溶黄酮对H2O2的清除作用，结果见图3。

按照测定凤头姜仔姜、老姜醇溶黄酮对H2O2的清除效果的方法绘制对H2O2清除能力的剂量-效应关系图并拟合回归方程，见图3中c。两种生姜醇溶黄酮浓度越大，其对H2O2的清除作用越强。根据回归方程计算可得出凤头姜仔姜、老姜的IC50为（0.172 3±0.002 1），（0.172 0±0.004 4） μg/mL，由此可见凤头姜老姜对H2O2的清除能力较强。

2.4 凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮对DNA损伤的保护作用

以60%乙醇为溶剂，配制0.04，0.07，0.10，0.16，0.20 mg/mL的凤头姜老姜醇溶黄酮溶液，0.02，0.05，0.09，0.16，0.18 mg/mL的凤头姜仔姜醇溶黄酮溶液，按照1.3.6实验方法测定对DNA损伤的保护作用，结果见图4。

按照测定凤头姜仔姜、老姜醇溶黄酮对DNA损伤的保护作用的方法绘制对DNA损伤保护作用的剂量-效应关系图并拟合回归方程，见图4中c。两种生姜醇溶黄酮对DNA损伤的保护作用随着醇溶黄酮浓度的增加而增强，根据回归方程可计算凤头姜仔姜、老姜的IC50分别为（6.832 0±1.020 6），（8.547 0±0.461 6） μg/mL，由IC50可以看出凤头姜仔姜醇溶黄酮对DNA损伤的保护作用强于老姜。

2.5 凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮抗氧化效果对比

利用SPSS软件对两种生姜醇溶黄酮对O2-·、·OH、H2O2的清除能力和DNA损伤保护作用的IC50进行T检验，结果见图5。

对比图5中的IC50可以看出，凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮对H2O2的IC50值最小，而对O2-·的IC50值最大，说明对H2O2清除体系最敏感，对O2-·体系敏感性最差。此外，凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮抗氧化能力有差异，通过T检验可以看出，凤头姜仔姜醇溶黄酮除在H2O2体系中清除效果与老姜的无显著差异外，在其他3种抗氧化体系中，凤头姜仔姜醇溶黄酮的抗氧化能力显著强于老姜，这说明抗氧化体系对生姜醇溶黄酮抗氧化能力影响较大，但4种抗氧化体系的相关性尚不明确，因此以凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮对4种抗氧化体系的IC50进行相关性分析，结果见图6。

由图6可知，在4种抗氧化体系中， O2-·清除体系和·OH清除体系、H2O2清除体系、DNA损伤保护体系之间呈显著正相关，可能是因为生物體内产生的自由基主要包括O2-·、·OH、脂质过氧化产物、单线态氧等自由基，而O2-·是第一氧自由基[21-22]，说明O2-·与其他自由基的产生具有相关性，所以导致抗氧化剂对它们的清除作用也有相关性。此外，凤头姜仔姜和老姜醇溶黄酮对DNA损伤的保护作用与O2-·和·OH显著相关，可能是因为生物体内自由基如O2-·、·OH、脂质过氧化产物会引起核酸分子破坏、碳水化合物碳链断裂等，即DNA损伤是由自由基引发的。

3 结论

本文采用4种抗氧化体系评价了不同生姜醇溶黄酮对O2-·、·OH、H2O2的清除能力及对DNA损伤的保护作用，通过比较IC50发现醇溶黄酮对O2-·、·OH的清除效果以及对DNA损伤的保护作用由弱到强依次为凤头姜老姜、仔姜；对H2O2的清除效果由弱到强依次为凤头姜仔姜、老姜。通过对凤头姜老姜、仔姜醇溶黄酮不同抗氧化体系的IC50值进行T检验分析发现，凤头姜仔姜醇溶黄酮的抗氧化能力显著强于老姜，但过氧化氢体系除外。产生此差异的原因可能是凤头姜在生长代谢过程中，黄酮类化合物的种类及相对含量发生了改变，李东芹[23]研究发现产自山东安丘的老姜中姜烯酚、姜酮及其甲基化衍生物含量高于仔姜，但姜酚系列乙酰化衍生物的含量低于仔姜。而凤头姜中黄酮类化合物的种类和相对含量的变化规律有待进一步研究。

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