羊肉酶解液美拉德反应工艺优化及其对挥发性风味物质的影响

阿丽耶·司马义　热伊汉古丽·萨地克　冯作山　王晨　阿依古丽·阿力木

摘要：文章以羊肉酶解液为原料，以A420 nm和感官评分为指标，优化美拉德反应羊肉香精的最佳条件，并采用气相色谱-离子迁移谱联用技术（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）研究美拉德反应产物的挥发性风味物质变化。试验结果表明，美拉德反应的最佳添加参数：以羊肉酶解液为基准，反应温度115 ℃，反应时间120 min，初始pH值8，葡萄糖添加量1.4 g，L-半胱氨酸添加量0.8 g。所得反应产物呈红褐色，具有羊肉特有香气、海鲜风味及烧烤风味。从美拉德反应产物EMH-MRP-A和EMH-MRP-B中共检测出62余种挥发性风味物质，定性的有41余种挥发性风味物质，其中包括醛类17种、酮类10种、烯类4种、醇类3种、呋喃类3种、噻唑类2种、吡嗪类2种、吡啶类1种。2-呋喃甲硫醇、正壬醛、辛酸乙酯、3-甲基丁醛等化合物风味阈值较低，对整体香气具有重要的贡献作用。

关键词：酶解液；美拉德反应；还原糖；挥发性风味物质

中图分类号：TS202.3文献标志码：A 文章编号：1000-9973（2023）06-0021-07

Abstract： In this paper， with enzymatic hydrolysate of mutton as the raw material， A420 nm and sensory score as the indexes， the optimal conditions for Maillard reaction of mutton essence are optimized. The changes of volatile flavor substances in Maillard reaction products are studied by gas chromatography-ion mobility spectrometry （GC-IMS）. The test results show that the best addition parameters of Maillard reaction are as follows：based on the mutton enzymatic hydrolysate， the reaction temperature is 115 ℃， the reaction time is 120 min， the initial pH value is 8， the addition amount of glucose is 1.4 g and the addition amount of L-cysteine is 0.8 g. The obtained reaction product is red and brown， with the unique aroma of mutton， seafood flavor and barbecue flavor. More than 62 volatile flavor substances are detected in Maillard reaction products EMH-MRP-A and EMH-MRP-B， and more than 41 volatile flavor substances are qualitatively detected， including 17 aldehydes， 10 ketones， 4 alkenes， 3 alcohols， 3 furans， 2 thiazoles， 2 pyrazines and 1 pyridine. 2-Furan methyl mercaptan， n-nonanal， ethyl octanoate， 3-methylbutyraldehyde and other compounds have lower flavor threshold， and make an important contribution to the overall aroma.

Key words： enzymatic hydrolysate; Maillard reaction; reducing sugar; volatile flavor substances

收稿日期：2022-12-09

基金項目：新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目（2021D01B55）

作者简介：阿丽耶·司马义（1995－），女，硕士，研究方向：食品风味化学。

*通信作者：阿依古丽·阿力木（1985－），女，副教授，博士后，研究方向：食品风味化学。

肉味香精是最近发展最快的香精，香精在食品行业用途最广泛[1]。美拉德反应对产生肉类风味化合物的贡献最大，通过改变原料、温度、时间等工艺条件，可以制备出不同风味的物质。目前，国内已有通过Maillard反应制备肉味香精的相关研究。例如，宋焕禄等[2]利用鸡肉酶解物等原料制备了肉香味化合物；肖作兵等[3]以猪骨素、糖类物质等为原料，通过美拉德反应制备出高品质的天然肉味香精。李宏梁等[4]以牛肉、大豆蛋白粉、葡萄糖和半胱氨酸等为原料制备了牛肉味香物质。

美拉德（Maillard）反应是含游离氨基的化合物和还原糖在加热条件下发生缩合反应，经过反应后，最终生成棕色的大分子物质类黑精[5-6]。美拉德反应可以改善食品的香、色、味、质，是食品加工过程中很重要的因素，在调味料的资源开发中有着十分重要的意义[7-8]。

美拉德反应是在食品加工过程中获得风味物质的重要过程，本研究主要简述了美拉德反应的制备方法和工艺优化，研究美拉德反应对食品行业的影响，并用GC-IMS技术研究在产物中物质的变化[9]。这种技术结合了气相色谱（GC）的高分离能力和离子迁移光谱法（IMS）的快速响应特征，已广泛用于药物检测、疾病监测、环境保护，尤其是食品风味分析。

1 材料和方法

1.1 试验材料和设备

1.1.1 材料

羊肉（mutton）蛋白酶解液：利用木瓜蛋白酶和复合风味蛋白酶分步酶解羊肉获得；葡萄糖、L-半胱氨酸：上海源叶生物科技有限公司；木瓜蛋白酶、复合风味蛋白酶：上海索莱宝生物科技有限公司。

1.1.2 设备

3-30K高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；DZKW-S-4电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司；LDZX-50KB蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂。

1.2 试验方法

1.2.1 羊肉蛋白肽的制备

根据不同条件优化出的样品酶解条件及参考文献[10]对羊肉蛋白进行酶解。取新鲜去脂羊肉后，洗净磨碎，于85 ℃加热15 min，保持温度不变，使羊肉的蛋白质变性，在低温条件下冷却后按1∶3加入蒸馏水，在最适酶解pH值和温度下先后添加内切酶及外切酶进行酶解[11]，然后在100 ℃高温条件下灭酶10 min。将样品在4 ℃下以8 000 r/min离心20 min，上清液在冷冻干燥的技术条件下得到的产物即为羊肉酶解肽，将样品放在冰箱中备用[12]。

1.2.2 羊肉酶解物美拉德反应制备肉味香精

参照李超[13]的方法。

1.2.3 美拉德反应产物褐变指数A420 nm的测定

参照童彦等[14]的方法。

1.2.4 美拉德反应条件优化

考察葡萄糖添加量（0.2，0.6，1，1.4 g）、反应时间（60，80，100，120 min）、反应温度（95，105，115，125 ℃）、L-半胱氨酸添加量（0.2，0.4，0.6，0.8 g）、初始pH值（6.5，7，7.5，8）对美拉德反应的影响。

1.2.5 正交试验优化美拉德反应条件

在单因素试验的基础上，以褐变度和感官评分为指标，选择葡萄糖添加量、时间、温度、L-半胱氨酸添加量、初始pH值为影响因素，设计正交试验，因素及水平见表1。

1.2.6 Maillard反应产物分析

采用气相色谱-离子迁移谱联用技术（GC-IMS）对美拉德反应所得到的样品进行分析，选用MXT-5色谱柱（15 m×0.53 mm×0.1 μm）进行气相色谱分析，流速为1.2 mL/min，升温程序：起始温度45 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升到200 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min升到250 ℃，保持3 min。

1.2.7 感官评价

邀请经过感官培训的专业人员10人（5男5女）对美拉德反應产物进行感官评价。主要从色泽、气味、滋味方面进行评分，满分10分，感官评分越高说明试验结果越好，接受程度越高，感官评价标准见表2。

1.2.8 数据处理

数据处理利用Excel软件，采用SPSS 22.0软件分析显著性差异，采用Origin 2018 软件绘图，结果以“平均值±标准差”来表示，对单因素进行试验，显著性差异采用新复极差法。每次测试重复3次，取平均值作为结果。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 反应温度对美拉德反应产物A420 nm及感官评分的影响

由图1可知，褐变度随着温度的升高呈增加趋势，感官评分随着温度的升高呈现先升高后降低的趋势（P＜0.05），温度达到115 ℃时感官评分最高，色泽呈棕色，黑精类物质增多[15-16]，超过115 ℃时感官评分降低。因此，选择反应温度105～125 ℃进行后续正交试验。

2.1.2 反应时间对美拉德反应产物A420 nm及感官评分的影响

由图2可知，褐变度随着时间的延长呈上升趋势，褐变度显著增大（P＜0.05），感官评分呈现先升高后降低的趋势，感官评分在时间达到100 min时最高，产物的烧烤味逐渐增加。在时间超过100 min后感官评分开始降低。 因此，选择反应时间80～120 min进行后续正交试验。

2.1.3 初始pH值对美拉德反应产物A420 nm及感官评分的影响

由图3可知，当pH值＞7时，反应颜色生成得快，pH值＜7时，吡嗪类化合物及含硫化合物难以形成。在pH值＜7时，反应速度明显下降。而在pH值＞7时，反应速度明显加快[17]。褐变度随着初始pH的增加呈现上升趋势（P＜0.05），pH为7.5时感官评分最高，风味较好。因此，选择初始pH 7.0～8.0进行后续正交试验。

2.1.4 葡萄糖添加量对美拉德反应产物A420 nm及感官评分的影响

由图4可知，褐变度随着葡萄糖添加量的增加呈上升趋势（P＜0.05），感官评分呈现先升高后降低的趋势，葡萄糖添加量达到1 g后感官评分开始下降，产生焦糊味[18]。因此，选择葡萄糖添加量0.6～1.4 g进行后续正交试验。

2.1.5 L-半胱氨酸添加量对美拉德反应产物A420 nm及感官评分的影响

由图5可知，褐变度随着温度的升高呈现先上升后下降的趋势（P＜0.05），感官评分在L-半胱氨酸添加量为0.6 g时最高，呈现烧烤味及鲜味。但是，L-半胱氨酸添加量超过0.6 g时感官评分开始下降。因此，选择L-半胱氨酸添加量0.4～0.8 g进行后续正交试验。

2.2 正交试验结果

由表3可知，综合评分7.566为最高分，可以作为理想条件。根据综合得分高低排序，较好的条件为反应温度115 ℃、反应时间120 min、初始pH 8、葡萄糖添加量0.6 g、L-半胱氨酸添加量0.4 g，样品命名为EMH-MRP-A。

根据R=最大值-最小值，确定各因素的R值，平均R值越高，说明对体系的影响越大，通过比较4个因素的大小，得出4个因素的优先顺序为EMH-MRP温度（A）＞时间（B）＞L-半胱氨酸添加量（E）>葡萄糖添加量（D）＞初始pH（C）。其中反应温度、反应时间和葡萄糖添加量是影响美拉德反应产物的主要因素，较好的反应条件为A2B3C3D3E3，即反应温度为115 ℃，反应时间为120 min，初始pH为8，葡萄糖添加量为1.4 g，L-半胱氨酸添加量为0.8 g，命名为EMH-MRP-B。检测选出的样品EMH-MRP-A和EMH-MRP-B的挥发性风味物质。美拉德反应的最佳工艺参数组合为A2B3C3D3E3，即反應温度为115 ℃，反应时间为120 min，初始pH值为8，葡萄糖添加量为1.4 g，L-半胱氨酸添加量为0.8 g。

2.3 两种不同浓度美拉德反应产物EMH-MRP-A和EMH-MRP-B的GC-IMS 挥发性成分分析

不同浓度美拉德反应产物EMH-MRP-A和EMH-MRP-B的GC-IMS三维谱图见图6。

由图6可知，不同浓度美拉德反应产物EMH-MRP-A和EMH-MRP-B的挥发性有机物的浓度和种类存在差异[19]。由图7和图8可知，EMH-MRP-B中的化合物含量比EMH-MRP-A中多，EMH-MRP-B的浓度比EMH-MRP-A高很多。

2.4 美拉德反应产物EMH-MRP-A和EMH-MRP-B挥发性风味物质的影响

指纹图谱为2种不同浓度的酶解物美拉德反应产物的挥发性物质对比，发现可通过挥发性物质的种类和浓度对2种不同浓度酶解物美拉德反应产物进行区分。由图9可知，部分物质只在某一样品中浓度较高，高于其他样品中，可用这些物质区分不同样品的差异，样品中这些物质的规律需要结合其他信息进一步解释导致上述现象的原理。通过观察得出，2种不同浓度的酶解物美拉德反应产物的挥发性物质都存在差异[20-23]。A区域物质在A样品中浓度较高，主要物质有丙酮、乙醇、2-戊酮、噻唑、己醛、苯甲醛、2，4，5-三甲基噻唑、5-甲基噻吩-2-甲醛、正壬醛、辛醛等。B区域物质在B样品中浓度较高，主要物质有3-戊酮（单体）、3-戊酮（二聚体）、2，6-二甲基吡啶、2，6-二甲基吡嗪（单体）、2-戊基呋喃、乙酰呋喃（单体）、乙酰呋喃（二聚体）、3-甲基丁醛（单体）、3-甲基丁醛（二聚体）、乙硫醚、环戊酮、2，4-庚二烯（单体）、2，4-庚二烯（二聚体）等。产物中的物质也有同时具有单体和二聚体。颜色的深度代表挥发性风味物质含量的高低[24]。

由表4可知，EMH-MRP-A和EMH-MRP-B中挥发性风味物质共62余种，定性检测出的挥发性风味物质有41余种，其中醛类物质17种、酮类物质10种、烯类物质4种、醇类物质3种、呋喃类物质3种、噻唑类物质2种等，多数特殊的化合物质单体和二聚体状态同时存在。

杂环类化合物一般源于美拉德反应，对风味的贡献也不小，作用很大，是食品产生肉类特征风味的一种化合物[25-26]，含硫化合物如糠基硫醇、2-糠酸甲酯、乙酰呋喃（单体）、乙酰呋喃（二聚体）、2-糠酸甲酯、5-甲基糠醛、2-戊基呋喃在羊肉酶解液美拉德反应中都能检测到，是重要的羊肉特征风味物质。在上述羊肉中未检测到甲硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇等风味化合物，表明美拉德反应会改变羊肉酶解液原有的风味，生成羊肉特征的风味。其中，2-甲基-3-呋喃硫醇具有肉香和芳香；丙醛来自氨基酸的降解，具有煮土豆香味和烤肉味[27]。

醇类化合物主要来源于脂肪氧化降解，醇类物质是羊肉风味物质中主要的挥发性成分之一，主要来源于不饱和的阈值较低的醇类化合物[28]。本次羊肉酶解液美拉德反应中检测到的醇类化合物有乙醇 、糠基硫醇、糠硫醇、2-呋喃甲硫醇等。

醛类化合物主要是脂肪氧化降解生成的，阈值很低的醛类化合物具有脂肪香味，对羊肉的香味生成贡献作用也很大[29]。2-甲基丁醛、乙醛、辛醛、苯乙醛等化合物是煮羊肉重要的风味物质。本次羊肉酶解美拉德反应中检测到的醛类化合物有2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、正壬醛、正丁醛、己醛、庚醛、苯甲醛、5-甲基糠醛等。正乙醛具有清香味，苯乙醛具有香甜味、玫瑰花香，对羊肉风味贡献作用很大。

酯类化合物主要来自醇和脂肪酸的综合作用，羊肉香型风味物质中检出2-糠酸甲酯、辛酸乙酯，具有果香味。同样，酯类化合物的阈值比较高，对风味的作用不明显，作用不大[30]。

3 结论

通过外源添加葡萄糖和L-半胱氨酸，以羊肉酶解液为试验原料，以感官评分和A420 nm为试验指标，通过美拉德反应制备羊肉风味香精。在单因素试验结果的基础上，采用L18（35）正交试验优化出羊肉酶解液美拉德反应的最佳反应条件。反应温度115 ℃、反应时间120 min、初始pH值8、葡萄糖添加量1.4 g、L-半胱氨酸添加量0.8 g时美拉德反应产物呈红褐色，具有羊肉特有香气、海鲜风味及烧烤风味。

进一步通过气相色谱-离子迁移谱联用技术（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）对羊肉酶解液及其美拉德反应产物的挥发性物质进行分析，EMH-MRP-A和EMH-MRP-B中共检测出62余种挥发性风味物质，定性的有41余种挥发性风味物质，其中包括16种醛类物质、10种酮类物质、4种烯类物质、3种醇类物质、3种呋喃类物质、2种噻唑类物质、2种吡嗪类物质、1种吡啶类物质，多数物质同时具有单体和二聚体。其包括了风味阈值较低、对整体香气具有重要贡献的2-甲基丁醛、2-呋喃甲硫醇、正壬醛、辛酸乙酯、3-甲基丁醛等特征化合物。本研究为利用羊肉开发高品质的羊肉香精提供了理论依据。

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