LC/MS/MS法同时测定八宝惊风散中5种成分的含量

张艳萍,张 敏,周宗洲,黄婉锋, 何作民

(1.广东省佛山市食品药品检验检测中心,广东 佛山 528051; 2.广东省佛山市疾病预防控制中心,广东 佛山 528051)

八宝惊风散为儿科经典用药,由钩藤、防风、黄芩、沉香等19味中药粉碎成细粉,过筛,混匀而成,具有退热镇惊、祛风化痰等功效[1-2],由于效果明显,深受儿童消费者的青睐。八宝惊风散现行药品执行标准为卫生部颁药品标准(中药成方制剂第20册)WS3-B-3742-98,标准较简单,只包括性状项、茯苓、川贝母、黄芩、珍珠显微鉴别、2项理化鉴别、丁香的薄层鉴别和检查项,目前尚未有定量指标,这对其产品研究和临床应用具有阻碍作用。由于处方成分复杂,八宝惊风散的质量控制手段有薄层鉴别、单组分气相色谱法或液相色谱法[3-10]。经文献查阅,关于采用液质联用法对八宝惊风散中单一或多种组分的含量检测研究尚未报道。本实验采用正离子扫描,多反应监测模式,建立同时测定八宝惊风散中钩藤活性成分异钩藤碱、防风活性成分升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷,黄芩活性成分黄芩苷、沉香活性成分沉香四醇的LC-MS/MS检测方法。以期为该中成药的质量控制提供更全面、高效、可靠的分析方法,为其质量标准提高提供技术支撑。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Xevo-TQ 三重四级杆液质联用仪(美国Waters);ELGA Q7纯水超纯水机(法国威立雅);XPR10微量天平(梅特勒-托利多);BS224S电子天平(德国Sartorius);S180/H超声波清洗器(Elma);MS2迷你涡旋振荡器(德国IKA);CT14RD 台式高速冷冻离心机(上海天美)。

1.2 试剂

对照品升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基维斯阿米醇苷(批号 111523-200405,含量100%)、黄芩苷、异钩藤碱全部购自中国食品药品检定研究院。色谱纯试剂:乙腈、甲醇、甲酸,水为实验用超纯水。药品八宝惊风散(4家生产企业共10批次)均来源于市售。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备

2.1.1 对照品储备液的制备

精密称取异钩藤碱约4mg、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷约10mg、沉香四醇、黄芩苷约20mg置于10mL量瓶中,加甲醇溶解并定容,配制含量范围为0.40～2.0mg/mL的对照品单标储备液。

2.1.2 混合对照品中间液的制备

准确移取上述对照品储备溶液适量置同一量瓶(20 mL),用甲醇稀释定容, 配制成含量范围为2.0～10.0μg/mL的混合对照品中间液。

2.1.3 混合标准使用液的制备

精密移取混合对照品中间液适量,配制异钩藤碱含量范围约为0.01～0.20μg/mL,升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷含量范围约为0.025～0.50μg/mL,沉香四醇、黄芩苷含量范围约为0.05～1.0μg/mL的混合标准使用液。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取八宝惊风散细粉约0.5g置于20mL量瓶中,加入适量甲醇,涡旋30s,放置超声清洗器提取20min,放冷,甲醇定容,摇匀后转移至10mL的离心管中,以12000 r/min离心 5 min,取适量上清液过0.22μm滤膜获得供试品溶液,如样品中部分成分浓度超出曲线线性范围,可采用10%乙腈溶液稀释,再进样分析。

2.3 色谱与质谱条件

2.3.1 色谱条件

色谱柱 ACQUITY UPLC C18 柱(1.7μm,2.1mm×100 mm),流动相为0.1%甲酸溶液(A)-甲醇溶液(B),流速:0.30mL/min,柱温:30℃, 进样量:1μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.3.2 质谱条件

电喷雾离子源,离子源:150℃,正离子监测,毛细管电压3.6KV,多反应监测,氩气为碰撞气,各成分质谱检测参数见表2,标准图谱见图1。

图1 标准TIC图谱

表2 各成分质谱检测参数

3 结果

3.1 标准曲线与线性试验

取混合标准使用溶液各1μL,按“2.3” 项条件进行分析,以对照品峰面积Y对其浓度X进行回归,结果见表3,结果表明各成分在各自质量浓度范围内线性关系良好。按照样品称样量0.20g,定容20mL,以3∶1信噪比为检出限,以10∶1为定量限信噪比,计算各成分检出限、定量限,结果见表3。

表3 各成分的线性回归方程、相关系数等

3.2 精密度试验

对某一混合标准使用溶液连续进样 6次,测得升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、异钩藤碱峰面积的RSD分别为3.0%、4.2%、3.0%、4.8%、2.0%,结果表明,仪器具有良好的精密度。

3.3 重复性试验

称取八宝惊风散(批号170302)适量共6份,按“2.2”项制备6份供试品溶液;按“2.3”项进样测定,计算升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、异钩藤碱的含量平均值分别为106.3mg/kg、640.2mg/kg、58.9mg/kg、2401.7mg/kg、2.15 mg/kg,RSD分别为4.2%、2.9%、3.7%、2.0%、4.8%,表明该法重复性较好。

3.4 稳定性试验

取“2.2”项供试品溶液(批号170302),分别于0h、1.0h、2.0h、4.0h、8.0h、12.0h、24.0h进行测定,结果升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、异钩藤碱峰面积的RSD依次为4.1%、3.8%、3.2%、4.3%、3.5%,表明样品溶液在24h内呈现良好稳定性。

3.5 回收率实验

精密称取已知含量的八宝惊风散(170302)6份,每份称量约0.5g,置于20mL量瓶中,加入各对照品储备溶液,按“2.2”项制备待测液,进样分析,计算回收率,结果见表4。

表4 各成分回收率和RSD(n=6)

3.6 方法应用

在本实验条件下,按照“2.2”项对10批八宝惊风散药品制备供试品溶液,按“2.3”项下色谱与质谱条件进行测定,外标法计算各成分的含量,其代表性图谱见图2,结果见表5。

图2 样品总离子流图 批号170302

表5 八宝惊风散中各成分的含量测定结果(mg/kg)

4 讨论

4.1 提取方法优化

为确保八宝惊风散中各成分的有效提取与准确定量,本文考察了多种提取溶剂(50%甲醇溶液、甲醇、50%乙腈溶液、乙腈)对提取效率的影响,结果表明,采用纯甲醇提取可获得满意结果。同时考察了不同的超声提取时间(10 min、20 min、30 min)对提取效率的影响,发现超声提取20 min能满足检测方法要求。

4.2 色谱条件的优化

目前对于八宝惊风散的质量控制的研究主要为HPLC、UPLC等分析方法,各成分如需完全分离,洗脱时间较长,本研究运用特异性高的UPLC-MS/MS法,能显著缩短样品分析时间,试验分别考察了甲醇和乙腈与挥发性缓冲液(0.1%甲酸水溶液、10 mmol乙酸铵溶液)组成的流动相体系对八宝惊风散中5种成分的离子化程度的影响。结果表明,当流动相体系为甲醇-0.1%甲酸时,各组分响应最高,峰型最优。同时通过优化此流动相体系的梯度洗脱程序,使5种成分在5min内获得最佳分离。采用亚二微米小颗粒填料色谱柱能获得较高灵敏度和分离度,本文分别对 BEH C8、C18色谱柱进行了考察,结果发现,C18柱无论在峰型方面还是分离度方面,均优于C8柱,因此,本实验选择C18色谱柱。

4.3 不同生产厂家样品中5种成分的含量分析

从表5可知,该研究中5种组分在四家药品生产企业均有检出,但由于各企业药材原料的生产产地和来源的差异,升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、异钩藤碱的含量存在不同程度的差异。黄芩苷含量最高,含量范围为1860.7～3740.2mg/kg,异构藤碱含量最低,含量范围为0.82～7.89mg/kg,同时,5种成分在不同厂家,不同批号其其含量相差也较大。不同批号中异钩藤碱的含量差异高达10倍,八宝惊风散处方中主药包括钩藤、防风。因此,八宝惊风散中异构藤碱、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量的差异将有效体现改药品的质量。

建立同时测定八宝惊风散中升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、异钩藤碱的液质检测方法,该法灵敏度高,分析速度快,回收率好。LC/MS/MS法能有效排除样品基质干扰,结果准确、可靠,可为八宝惊风散质量标准提高、药效物质深入研究等提供技术参保障用药安全。