下调MAC30对乳腺癌细胞焦亡、血管生成及ATP1A2蛋白的作用机制

潘蕾蕾,马俊,叶亭亭,陈剑平 （. 宣城中心医院心胸乳腺外科，安徽 宣城 4000；. 皖南医学院弋矶山医院甲乳外科，安徽 芜湖 4000）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，2020年乳腺癌新增人数约226万，已经超过肺癌成为全球发病率最高的恶性肿瘤[1]。手术及放化疗是临床治疗乳腺癌的主要方法，但放疗抵抗或化疗耐药会影响患者疗效及预后[2]。细胞焦亡又称细胞炎性坏死，主要依赖Gasdermin(GSDM)蛋白调节细胞生物活性。有研究表示，caspase-3可通过切割GSDM蛋白N端结构增加细胞焦亡，从而降低癌细胞化疗耐药性[3]。乳腺癌细胞在缺血环境下无法进行增殖及转移，肿瘤血管生成可为癌细胞活化提供血供，从而促进乳腺癌疾病进展。因此，众多学者认为可将抑制肿瘤血管生成作为抗乳腺癌的靶点[4-5]。现阶段，在血管新生的病理生理过程中，细胞自噬作用持续存在，在血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）诱导的血管生成中，自噬相关信号可通过调控血管内皮细胞表面内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)表达而促进血管生成。有研究发现，Na+-K+-ATP酶的α亚单位在肿瘤中存在异常表达，对癌细胞增殖及迁移等具有调控作用[6]。Na+-K+-ATP酶α2亚基(ATP1A2)基因在乳腺癌中高表达，其功能缺失会使细胞内Ca2+增多，从而参与癌症的发生发展。但ATP1A2基因与肿瘤血管生成及细胞自噬的关系目前尚不清楚。

脑膜瘤相关蛋白(meningioma-associated protein,MAC30)是胰岛素生长因子结合蛋白家族成员之一，主要存在于细胞核的内质网中，并在机体组织中广泛表达[7]。在乳腺癌组织中MAC30表达升高，通过下调MAC30能够抑制肿瘤细胞侵袭及迁移，但是关于下调MAC30对乳腺癌细胞焦亡、血管生成及ATP1A2蛋白水平的影响目前尚未可知。因此，本研究通过体外培养乳腺癌细胞，观察下调MAC30对乳腺癌的改善作用，以期为其治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞来源及细胞培养

乳腺上皮细胞HMEC和乳腺癌细胞MDA-MB231、MCF-7、SKBR3均购自中国科学院典型培养物保藏中心，于37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养，24 h后弃去培养基，置于含1%双抗的10%胎牛血清中培养，培养条件同上，细胞生长至80%~90%时进行传代，生长至90%时终止消化反应，培养基中2~3 d传代。

1.2 试剂与仪器来源

MAC30 Lenti-shRNA和阴性对照Lenti-shRNA(NC-shRNA)由上海吉凯基因公司合成；RPMI 1640培养基购自武汉益普生物科技有限公司；ATP1A2多克隆抗体购自武汉艾美捷科技有限公司；鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自上海圻明生物科技有限公司；山羊抗小鼠IgG购自武汉纯度生物科技有限公司；CCK-8法试剂盒购自上海Beyotime公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司；ECL显色试剂盒购自北京索宝莱科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自上海雅酶生物医药科技有限公司；酶标仪（型号：HBS-1096A）购自上海研卉生物科技有限公司；TDZ4-WS低速台式离心机购自湖南湘瑞生物有限公司；凝胶成像系统及Western blot电泳系统均购自北京赛百奥科技有限公司；荧光定量PCR仪购自中山大学达安基因股份有限公司。

1.3 qRT-PCR检测HMEC、MDA-MB231、MCF-7和SKBR3细胞MAC30 mRNA表达

使用TRIzol法提取HMEC、MDA-MB231、MCF-7和SKBR3细胞中总RNA，无核酸酶溶解后转录为cDNA，获得反应体系，条件为：42 ℃ 60 min，72 ℃ 5 min，4 ℃终点。采用qRT-PCR检测，每个细胞设置6个复孔，上下游引物均为0.5 μL，反应条件：95 ℃预热3 min，95 ℃ 5 s，58 ℃退火，40个循环。引物序列：MAC30上游为5'-CTCAGCCACATCCCC-3'，下游为5'-CACAAGCTCG CAAAAC-3'；β-actin上游为5'-GGAAATCGTGCGTGACATTA-3'，下游为5'-GGAGCAATGATCTTG ATCTTC-3'。根据2-△△Ct法计算各组细胞中MAC30相对表达量。

1.4 MCF-7细胞分组

取MCF-7细胞，待生长至50%~60%后采用培养基制成单个细胞悬液，分为乳腺癌组（MCF-7细胞）、NC组（MCF-7细胞转染MAC30-NC-shRNA）、MAC30 shRNA组（MCF-7细胞转染MAC30-shRNA）、ATP1A2组（MCF-7细胞转染ATP1A2-shRNA）及MAC30 shRNA+ATP1A2组（MCF-7细胞转染MAC30-shRNA、ATP1A2-shRNA）。

1.5 MAC30 shRNA慢病毒转染

将生长状态良好的MCF-7细胞制备成5×107/mL的细胞悬液，接种至6孔板中，37 ℃孵育24 h，待细胞达到30%时更换培养基，加入感染增强液，根据最佳感染复数及病毒滴度，加入MAC30 Lenti-shRNA和阴性对照NC-shRNA培养液，次日换掉病毒培养液，加入1 mg新鲜培养基，96 h后采用qRT-PCR验证转染效率。

1.6 ATP1A2质粒转染

构建TP1A2质粒[7]，将MCF-7细胞接种于6孔板中，待细胞生长覆盖孔板80%~90%时开始转染，配制转染混合液，将4 μg质粒加入500 μL无血清培养基中，将5 μL ip 2000加入500 μL无血清培养液混匀，室温下静置20 min。PBS冲洗3次，加入1 mL Lipo⁃fectamine 2000转染混合液及无血清培养基1.5 mL，培养6 h后，换成常规培养基继续培养48 h。

1.7 MCF-7细胞增殖实验

采用CCK-8法检测各组MCF-7细胞增殖情况。将5×103个对数生长的MCF-7细胞接种至96孔板中，贴壁培养24 h后，加入CCK-8试剂(5 g/L)，每孔20 μL，再加入200 μL二甲基亚砜溶液，充分溶解15 min，分别于培养24 h、48 h、72 h、96 h时取出培养板，在酶标仪450 nm波长处检测吸光度OD值，实验3次，复孔2次。

1.8 MCF-7细胞焦亡实验

100 μL的Binding buffer重悬细胞后加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI混合液，室温避光孵育15 min，再加入400 μL含Binding buffer的细胞悬液，30 min后使用流式细胞仪进行检测。以AnnexinV-FITC+/PI+双阳性细胞百分率作为焦亡率。实验重复3次，取平均值。

1.9 体外血管形成实验

取48孔板，于冰上每孔加入60 μL基质胶溶液，然后在37 ℃、5%CO2的培养箱静置30 min使其凝固，取各组细胞进行消化、离心，弃掉上清液后重悬细胞，调整密度为2×105/mL接种于24孔板，在37 ℃、5%CO2的培养箱中进行培养，48 h后置于倒置显微镜下观察。计算5个视野的血管管腔数目，实验重复3次，取平均值。

1.10 Westerm blot检测各组细胞ATP1A2、SCr、AKT及PI3K水平

10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白（40 μg），转移至PVDF膜上后再用5%脱脂奶粉封闭2～3 h，加入一抗ATP1A2（1∶100)、SCr（1∶200）、AKT（1∶150）、PI3K（1∶200），内参为GAPDH（1∶2 000），4 ℃摇床孵育过夜。TBST冲洗3次，室温下与辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）结合孵育2 h，杂交冲洗。然后将膜浸入ECL工作液，计算目标蛋白与GAPHD之间的OD值，检测相对表达。实验重复3次，取平均值。

1.11 统计学分析

采用GraphPad Prism 8软件分析数据，各组数据服从正态分布，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，事后检验采用Bonferroni法进行组间两两比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HMEC、MDA-MB231、MCF-7和SKBR3细胞MAC30 mRNA表达

与HMEC细胞相比，MDA-MB231、MCF-7和SKBR3细胞MAC30 mRNA表达水平均升高（P<0.05），其中MCF-7细胞MAC30 mRNA表达水平最高，见图1。故本研究选择MCF-7细胞进行后续实验。

图1 HMEC、MDA-MB231、MCF-7和SKBR3细胞MAC30 mRNA表达

2.2 各组MCF-7细胞中MAC30 mRNA表达

乳腺癌组与NC组MAC30 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与乳腺癌组和NC组相比，MAC30 shRNA组MAC30 mRNA表达水平降低（P<0.05）；与MAC30 shRNA组相比，ATP1A2组MAC30 mRNA表达水平升高（P<0.05）；与ATP1A2组相比，MAC30 shRNA+ATP1A2组MAC30 mRNA表达水平降低（P<0.05），见图2。

图2 各组MCF-7细胞中MAC30 mRNA表达

2.3 各组MCF-7细胞增殖活性比较

24 h、48 h、72 h及96 h时，乳腺癌组与NC组MCF-7细胞增殖活性比较差异均无统计学意义（P>0.05）；与乳腺癌组和NC组相比，MAC30 shRNA组、ATP1A2组及MAC30 shRNA+ATP1A2组细胞增殖活性均降低（P<0.05）；MAC30 shRNA组与ATP1A2组细胞增殖活性比较差异无统计学意义（P>0.05）；与MAC30 shRNA组和ATP1A2组相比，MAC30 shRNA+ATP1A2组细胞增殖活性降低（P<0.05），见图3。

图3 各组MCF-7细胞增殖活性

2.4 各组MCF-7细胞焦亡率比较

MAC30 shRNA及ATP1A2质粒均可以诱发MCF-7细胞形态改变，主要体现在细胞体积缩小、细胞颗粒增多及大量焦亡。细胞之间连接较少，以MAC30 shRNA+ATP1A2组最佳，培养液出现大量细胞悬浮，见图4a。乳腺癌组与NC组MCF-7细胞焦亡率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与乳腺癌组和NC组比较，MAC30 shRNA组、ATP1A2组及MAC30 shRNA+ATP1A2组MCF-7细胞焦亡率均升高，其中MAC30 shRNA+ATP1A2组最高，而MAC30 shRNA组与ATP1A2组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见图4b。

图4 各组MCF-7细胞形态及细胞焦亡率比较

2.5 各组MCF-7细胞血管形成数目比较

乳腺癌组与NC组细胞血管形成数目比较差异无统计学意义（P>0.05）；与乳腺癌组和NC组相比，MAC30 shRNA组、ATP1A2组及MAC30 shRNA+ATP1A2组细胞血管形成数目减少（P<0.05），MAC30 shRNA组与ATP1A2组细胞血管形成数目比较差异无统计学意义（P>0.05）；与MAC30 shRNA组和ATP1A2组相比，MAC30 shRNA+ATP1A2组细胞血管形成数目减少（P<0.05），见图5。

图5 各组MCF-7细胞血管形成比较（ ×200）

2.6 各组MCF-7细胞ATP1A2、SCr、AKT及PI3K水平比较

乳腺癌组与NC组细胞ATP1A2、SCr、AKT及PI3K表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；与乳腺癌组和NC组相比，MAC30 shRNA组、ATP1A2组及MAC30 shRNA+ATP1A2组ATP1A2、SCr、AKT及PI3K表达水平降低（P<0.05）；MAC30 shRNA组与ATP1A2组ATP1A2、SCr、AKT及PI3K表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；与MAC30 shRNA组和ATP1A2组相比，MAC30 shRNA+ATP1A2组ATP1A2、SCr、AKT及PI3K表达水平降低（P<0.05），见图6。

图6 各组MCF-7细胞ATP1A2、SCr、AKT及PI3K水平比较

3 讨论

乳腺癌是我国发病率居首位的恶性肿瘤[8]。研究其治疗机制对于提高临床治疗效果、延长患者预后具有重要作用。本研究通过观察下调MAC30对乳腺癌细胞焦亡、血管生成及ATP1A2蛋白水平的影响，为乳腺癌的治疗提供参考。

MAC30是胰岛素样生长因子结合蛋白家族成员之一，位于染色体17q11.2，具有调节胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)活性的作用[9]。MAC30在人体内（包括肝细胞、支气管上皮细胞、巨噬细胞和树突状细胞等）广泛分布，在某些癌细胞和癌组织中也有表达[10]。MAC30在不同恶性肿瘤中的表达存在差异，如在胰腺癌[11]中呈低表达，而在胃癌[11]、结肠癌[11]及卵巢癌[12]中呈高表达。MAC30可能参与乳腺癌的生长和转移。乳腺癌组织中MAC30的表达高于正常组织。此外，肿瘤细胞表面的MAC30与癌细胞的浸润能力和转移能力有关。因此，MAC30也被认为是开发抗肿瘤药物的一个潜在靶点。在乳腺癌中MAC30过表达可被乳腺癌易感基因1(breast cancer1,BRCA1)诱导后突变，进而加快疾病进展。MAC30作为细胞内孤儿受体，可与sigma2受体结合进而促进癌细胞生长及分化[13]。本研究结果表明，在乳腺癌细胞中下调MAC30可抑制癌细胞增殖，加快焦亡。有研究证实，在胃癌细胞中抑制MAC30可降低蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)/AKT磷酸化及细胞周期蛋白B1(cyclin B1)活化，进而降低胃癌细胞活性，推测MAC30表达与肿瘤细胞活性相关[14]。细胞焦亡作为细胞程序性死亡的方式之一，当细胞焦亡发生时GSDMD活性升高，可通过促进细胞膜裂解而加快肿瘤细胞死亡[15]。下调MAC30可加快癌细胞焦亡，推测机制为抑制MAC30后磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/AKT受到抑制，可促进乳腺癌细胞焦亡，发挥抗肿瘤作用。

当肿瘤体积较小时，由于肿瘤细胞对营养物质和氧气等的需求量相对较低，可以通过弥散方式从周围组织中摄取所需的营养物质。但当肿瘤体积增大到一定程度时，弥散方式无法满足肿瘤细胞的需求，肿瘤细胞就会陷入缺氧状态。为了维持生长，肿瘤细胞开始释放一系列生长因子（如VEGF等）来刺激周围血管的生长和形成[16]。乳腺癌细胞中缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)激活可加快VEGF表达，进而加快细胞侵袭，诱导肿瘤血管形成[17-18]。本研究结果表明，下调MAC30可抑制乳腺癌细胞血管生成，从而抑制肿瘤生长，阻止疾病发展。MAC30虽然为IGF家族成员之一，但与IGF-1并不完全相同。MAC30在乳腺癌细胞中与IGF-1的表达水平一致。有研究发现，在乳腺癌细胞中，IGF-1的表达水平升高，并通过激活下游PI3K/AKT等，促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等恶性生物学行为[19-20]。在乳腺癌细胞中IGF-1表达升高并参与肿瘤血管生成，因此推测下调MAC30可以抑制IGF-1活性，降低肿瘤组织中VEGF表达，减少血管形成数目，从而改善病情。本研究结果表明，下调MAC30后对ATP1A2活性具有调节作用，可以抑制乳腺癌的发生发展。

ATP1A2是一个编码钠钾泵α2亚基的基因，在细胞膜上扮演着重要的离子输送功能。现阶段，随着对ATP1A2基因研究的深入，其被认为与乳腺癌的发生发展存在一定关系。有研究表明，ATP1A2在乳腺癌组织中的表达水平显著高于正常组织，且ATP1A2高表达乳腺癌患者预后往往不佳[21]。ATP1A2对肿瘤细胞生物活性具有调控作用。有研究表明，上调ATP1A2可促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭，而对其抑制后则能够减少乳腺癌细胞的迁移和侵袭[22]。本研究推测在乳腺癌中，MAC30的过表达可以调节SCr/PI3K/AKT通路的活性，从而促进肿瘤的增殖和侵袭，相反的抑制MAC30可能降低SCr/PI3K/AKT信号通路表达，从而发挥抗肿瘤血管生成的作用。本研究表明下调MAC30可以抑制ATP1A2、SCr、PI3K、AKT表达，进而抑制癌细胞生长，减少血管生成，加快焦亡。

综上所述，下调MAC30可抑制乳腺癌细胞增殖及血管生成，加快焦亡，其机制与抑制ATP1A2表达相关。但本研究未进行动物相关实验，关于MAC30调节ATP1A2的相关机制还需要进一步探讨。