广丰千金薯烟草花叶病毒lncRNA 测序鉴定、原核蛋白表达及其序列分析4

尹明华，张艳红，李淑娟，段 俊，蒋晓峰

1. 上饶师范学院生命科学学院，江西 上饶 334001

2. 上饶农业技术创新研究院，江西 上饶 334001

3. 上饶市药食同源植物资源保护与利用重点实验室，江西 上饶 334001

4. 上饶市薯芋类作物种质保存与利用重点实验室，江西 上饶 334001

广丰千金薯DioscoreapolystachyaTurczaninow.cv. Guangfeng Qianjin 为薯蓣科薯蓣属多年生草本植物，原产于江西省上饶市广丰区少阳乡，为上饶市地方特色山药品种[1]。广丰千金薯肉质根状茎可菜药兼用，菜用绵密粉嫩、软糯爽口，药用可健脾养胃、滋肾益精、预防心血管病、增强免疫力、延缓衰老，是老少皆宜的滋补佳品，经济价值高，产品远销到东南亚和日本等国，深受消费者青睐[2]。在生产中，广丰千金薯由于长期采用营养繁殖，病毒感染严重，造成种性退化、产量下降、品质变劣、薯块变小、畸形、卖相差，农民收入受损[3]。因此，开展健康种苗研究，采用生物技术的方法脱除病毒，提纯复壮，提高产量，改善品质已成为广丰千金薯生产中亟待解决的问题。而脱除病毒的前提是需要鉴定广丰千金薯的病毒种类及其病毒基因序列信息。广丰千金薯的病毒种类及其基因序列信息一旦探明，即可利用分子生物学的手段去广丰千金薯试管苗脱毒效果进行快速鉴定。目前，对广丰千金薯的研究仅限于高产栽培[3]、微型块茎萌发[4]、离体快繁[2]、干旱胁迫[1]、遗传稳定性[5]、光合生理[6]等方面，但广丰千金薯病毒种类及其蛋白原核表达和基因序列分析方面的研究尚无报道。本实验通拟过lncRNA 测序鉴定广丰千金薯病毒种类及其相关基因，利用大肠杆菌重组技术表达广丰千金薯病毒蛋白，并采用生物信息学方法对其进行序列分析，旨在为广丰千金薯脱毒苗的培育和鉴定提供理论依据和技术基础。

1 材料与仪器

1.1 材料

样品采自江西省上饶市广信区少阳乡，由上饶师范学院王艾平教授鉴定为千金薯D.polystachyaTurczaninow. cv. Guangfeng Qianjin 试管苗。

1.2 仪器

Illumina Hiseq 4000 测序系统（美国Illumina公司）、DK-S22 型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、GL-21M 型高速冷冻离心机（湘仪离心机仪器有限公司）、LX-B150L 型不锈钢立式灭菌器（合肥华泰医疗设备有限公司）、SW-CJ-1FD 型超净工作台（苏净安泰有限公司）、ZQLY-180 型恒温摇床（上海知楚有限公司）、JY 92-IIN 型超声破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）、DW-86L626 型超低温冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）、蛋白纯化仪（美国Bio-rad公司，NGC Quest™ 10 Plus）、DYCZ-24DH 型SDS-PAGE 电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、Qubit 3.0 型核酸蛋白定量仪（美国Life 公司-美国生命技术公司）。

2 方法

2.1 广丰千金薯烟草花叶病毒种类及其蛋白基因的确定

2.1.1 RNA 提取 从江西铅山红芽芋试管苗植株上各采集100 mg 左右幼嫩叶组织，混合后提取小RNA。

2.1.2 RNA 质检 完成RNA 抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的质量。

2.1.3 RNA 片段化 采取约400～500 bp 样品放入Covaris M220 仪器中进行反转录。

2.1.4 文库构建 cDNA 片段末端补平，加A，加测序接头；琼脂糖凝胶电泳进行片段筛选，将目标区域的片段回收；通过PCR 扩增筛选未加上接头的片段；PCR 产物纯化，质检。试剂为TruSeq™ DNA Sample Prep Kit。

2.1.5 桥式PCR DNA 片段的一端与芯片上引物碱基互补，固定在芯片上；另一端随机与附近的另一种引物互补，也被固定住，形成“桥（bridge）”；PCR 扩增，产生DNA 簇；线性化成为单链。试剂为Hiseq PE Cluster Kit v4 cBot。

2.1.6 Illumina Hiseq 4000 测序 加入改造过的DNA 聚合酶和带有4 种荧光标记的dNTP，每次循环只掺入单种碱基；用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第1 轮反应所聚合上去的核苷酸种类；将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3’端黏性，继续聚合第2 个核苷酸；统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA 片段的序列。

利用SOAPdenovo v2.04（http://soap.genomics.org.cn/）拼接软件对质控后的全部clean data 进行denovo 初步组装，将组装得到的全部contig 与病毒数据库进行比对，筛选得到来自病毒的contig；然后利用MITObim v1.6 通过迭代比对，将测序的所有clean reads mapping 到这些contig 上进行延伸，通过gap close 获得病毒的全基因组序列。

利用DOGMA 软件（http://dogma.ccbb.utexas.edu/）对基因组中包含的gene 进行预测。将预测基因的蛋白序列与Nr 数据库进行blastp 比对（BLAST 2.2.28+），初步判断广丰千金薯的病毒种类及其相关基因。

2.2 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白基因的生物信息学分析

使用BioEdit 软件翻译基因序列为氨基酸序列，用ProtParam 预测酶的理化性质，用ProtScale 预测酶的疏/亲水性。使用GOR I 软件在线预测酶的二级结构。使用SWISS-MOLD 在线预测酶的三级结构。采用WoLFPsort 在线预测基因的表达部位。通过软件DNAMAN 和Bioedit 进行氨基酸序列比对，利用MEGA5.0 软件进行系统进化树的构建。

2.3 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白的大肠杆菌重组表达

2.3.1 感受态转化及阳性克隆筛选 从超低温冰箱中取出BL21（DE3）感受态细胞，置于冰上融化；加入质粒（pET-28a，5 μg），轻轻吹吸充分混匀，冰上放置30 min；水浴锅42 ℃热击90 s，冰上放置1 min；加入800 μL 预热LB 液体培养基，37 ℃158 r/min 培养50 min；6000 r/min 离心4 min，去部分上清（800 μL 体积），剩余菌液混匀后涂至氨苄抗性平板上；倒置平板，37 ℃培养 12～16 h 可见出现菌落（阳性克隆）。

2.3.2 阳性克隆小量表达与鉴定 挑选含重组质粒的单菌落至3 mL LB 液体培养基（氨苄抗性）中，37 ℃培养过夜后-20 ℃保种；分别挑选含重组质粒的单菌落至3 mL LB 液体培养基（氨苄抗性）中，37 ℃震荡培养至A600约0.6；取部分菌液作为对照组，余下菌液加入IPTG 诱导剂（终浓度0.1 mmol/L），16 ℃震荡培养12 h；分别取2 组菌液0.15 mL，12 000×g离心2 min，菌体沉淀以 40 μL 1×loading buffer 重悬裂解，SDS-PAGE 检测。

2.3.3 蛋白大量表达及破菌检测 取保存于-20 ℃的菌种100 μL 接种于100 mL LB 液体培养基（氨苄抗性）中震荡培养过夜；取100 mL 菌液接种于 2000 mL LB 液体培养基中，37 ℃扩大培养至A600约0.6，降低培养温度到30 ℃；加入IPTG诱导剂至终浓度0.1 mmol/L，16 ℃继续震荡培养12 h；8000 r/min 离心3 min 收集菌体，重悬于50 mL预冷NTA-0 缓冲液中，冰浴30 min；超声破碎菌体，参数设置为功率200 W、工作3 s、暂停4 s、99 个循环；16 000 r/min，4 ℃离心50 min，收集上清以及沉淀；取少量上清及沉淀进行SDS-PAGE 检测，剩余上清及沉淀至于4 ℃备用。

3 结果与分析

3.1 测序数据统计

对经过质量剪切前后的数据分别进行测序总碱基数、文库平均插入长度、Q20、Q30、平均测序深度统计，结果见表1。由表1 可知，建立的文库准确率很高。

表1 测序数据统计Table 1 Sequencing data statistics

3.2 基因组组装

利用SOAPdenovo v2.04 拼接软件对质控后的全部clean data 进行denovo 初步组装，将组装得到的全部contig 与病毒数据库进行比对，筛选得到来自病毒的contig；然后利用MITObim v1.6 通过迭代比对，将测序的所有clean reads mapping 到这些contig 上进行延伸，通过gap close 获得病毒的全基因组序列，最终组装结果的统计，广丰千金薯病毒种类是1 个，该病毒的总长度为6395 bp，其GC 含量为43.35%。

3.3 Gene 查找

利用DOGMA 软件对基因组中包含的gene进行预测，然后在进行人工矫正。gene 预测结果的统计可知，基因数量为6 个，基因总长度为6264 bp，基因平均长度为1043，基因间区GC 含量为44.65%。

3.4 基因功能注释

将预测基因的蛋白序列与Nr 数据库进行blastp比对（BLAST 2.2.28+），从而获得预测基因的注释信息。注释结果如表2 所示。由表2 可知，广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白基因包括复制酶1（replicase，ORF1）、复制酶2（ORF2）、RNA 聚合酶（RNA polymerase）、运动蛋白（movement protein，MP）、带电蛋白（charged protei）和外壳蛋白（coat protein，CP）。

表2 基因功能注释结果Table 2 Gene function annotation results

3.5 广丰千金薯烟草花叶病毒基因cDNA 序列

广丰千金薯烟草花叶病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2 基因cDNA 总长度和（G+C）含量见表3。广丰千金薯烟草花叶病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2 基因序列结果已经上传至GenBank 数据库，基因登陆号为OL944011。

表3 广丰千金薯烟草花叶病毒基因cDNA 序列Table 3 cDNA sequence of tobacco mosaic virus gene from D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.6 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白氨基酸序列

Protparam 预测显示广丰千金薯烟草花叶病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2氨基酸序列分析见表4。由表4 可知，广丰千金薯烟草花叶病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2 分别由159、268、474、40、1613 和1114 个氨基酸组成，相对分子质量分别为17 649.81、29 981.75、54 573.87、4 845.84、183 048.95 和125 860.14，等电点分别为5.09、8.90、6.83、11.89、6.57、6.53。

表4 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白氨基酸序列Table 4 Amino acid sequence of tobacco mosaic virus protein from D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.7 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白亲疏水性分析

经ProtScale 软件分析，广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白除ORF5 为疏水性蛋白质外，其余如ORF6、ORF4、ORF3、ORF1 和ORF2 均为亲水性蛋白质。

3.8 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白二级结构分析

通过GOR 软件预测，广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白二级结构分析见表5。由表5 可知，广丰千金薯烟草花叶病毒ORF5 二级结构由β-片层和无规则卷曲构成，ORF6、ORF4、ORF3、ORF1 和ORF2 的二级结构均由α 螺旋、β-片层、无规则卷曲构成。

表5 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白二级结构Table 5 Secondary structures of tobacco mosaic virus proteins from D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.9 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白三级结构分析

SWISS-MODEL 预测显示广丰千金薯烟草花叶病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2三级结构均为单体（图1）。

图1 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白三级结构Fig. 1 Tertiary structure of proteins of tobacco mosaic virus in D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.10 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白亚细胞定位

采用WoLFPsort 在线软件对广丰千金薯烟草花叶病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2基因的表达部位进行预测，结果表明，广丰千金薯烟草花叶病毒ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5和ORF6 分别定位于内质网、细胞核、细胞质、细胞核、线粒体、叶绿体中。

3.11 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白系统进化分析

从构建的进化树（图2）中可见，广丰千金薯烟草花叶病毒ORF6 与烟草花叶病毒CP 在一个分支下，这说明广丰千金薯烟草花叶病毒ORF6 在进化上与烟草花叶病毒CP 的亲缘关系较近，同源性为99.79%；广丰千金薯烟草花叶病毒ORF4 与烟草花叶病毒MP 在一个分支下，这说明广丰千金薯烟草花叶病毒ORF4 在进化上与烟草花叶病毒MP 的亲缘关系较近，同源性为99.38%；广丰千金薯烟草花叶病毒ORF3 与烟草花叶病毒RNA 聚合酶在一个分支下，这说明广丰千金薯烟草花叶病毒RNA 聚合酶（ORF3）在进化上与烟草花叶病毒 RNA 聚合酶的亲缘关系较近，同源性为99.23%；广丰千金薯烟草花叶病毒带电蛋白（ORF5）与烟草花叶病毒带电蛋白在一个分支下，这说明广丰千金薯烟草花叶病毒带电蛋白（ORF5）在进化上与烟草花叶病毒带电蛋白的亲缘关系较近，同源性为100%。广丰千金薯烟草花叶病毒复制酶（ORF1）与烟草花叶病毒复制酶在一个分支下，这说明广丰千金薯烟草花叶病毒复制酶（ORF1）在进化上与烟草花叶病毒复制酶的亲缘关系较近，同源性为99.38%。广丰千金薯烟草花叶病毒复制酶（ORF2）与烟草花叶病毒复制酶在一个分支下，这说明广丰千金薯烟草花叶病毒复制酶（ORF2）在进化上与烟草花叶病毒复制酶的亲缘关系较近，同源性为99.49%。

图2 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白系统进化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of proteins of tobacco mosaic virus in D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.12 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白的序列比对信息

广丰千金薯烟草花叶病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2 同源蛋白的序列比对信息见图3。图3 中“*”号区域是该蛋白家族的保守结构域。从图3 可知，广丰千金薯烟草花叶病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2 的序列与烟草花叶病毒相似，同源性均在99.49%以上，因此，可以利用烟草花叶病毒基因序列来进行广丰千金薯烟草花叶病毒的种类鉴别。

图3 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白氨基酸序列的同源性比较Fig. 3 Homology comparison of amino acid sequences of proteins of tobacco mosaic virus in D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.13 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白的大肠杆菌重组表达

转化BL21（DE3）感受态细胞，挑选AMP 抗性平板上长出的阳性斑进行扩大培养与表达纯化，结果见图4。由图4 可知，除了ORF5 蛋白太小（485 000）无法正常表达外，其他5 个蛋白（ORF1、ORF2、ORF3、ORF4 和ORF6）都成功表达，蛋白大小分别为183 050、125 860、54 570、29 980 和17 650。这说明，广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白基因的lncRNA 测序结果是准确的。

图4 广丰千金薯烟草花叶病毒的蛋白表达Fig. 4 Protein expression of tobacco mosaic virus in D. polystachya Guangfeng Qianjin

4 讨论

目前报道的山药病毒病害主要为山药花叶病毒病，生长初期为害症状不明显，到生长中后期症状严重，叶上出现褪绿斑，随后绿色花斑隆起，呈斑驳花叶、凸凹卷曲畸形、黄化或坏死，严重时整株矮化，生长缓慢，地下茎缩小，畸形，产量下降[7]。鄢明峰等[8]发现日本山药花叶病毒（Japanese yam mosaic virus，JYMV）为瑞昌山药花叶型病毒的病毒原，江西瑞昌、广西和日本共32 个JYMV 分离物按其地域来源形成了3 个独立的进化组群，表明JYMV 的进化与其地理来源具有明显的相关性。张蕾等[9]和Zou 等[10]均利用RT-PCR 手段检测到淮山药感染山药温和花叶病毒（Yam mild mosaic virus，YMMV）。Silva 等[11]利用RT-PCR 技术确定西非山药的主要危害病毒为山药花叶病毒。在本试验中，通过lncRNA 测序鉴定广丰千金薯烟草花叶病毒基因，并利用大肠杆菌重组技术成功表达了广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白，第1 次确定了广丰千金薯的主要危害病毒为烟草花叶病毒。

研究表明，山药花叶病毒（yam mosaic virus，YMV）是一种具有大约785 nm 长的弯曲丝状颗粒，由一种单链RNA 和一种外壳蛋白组成，很难传播到小范围的宿主，由蚜虫以非持久性方式传播，在热带地区的山药种植中造成了重要的经济损失[12]。YMV 基因组RNA 长度为9608 个核苷酸，包含编码3103 个氨基酸（aa）多蛋白的一个开放阅读框（open reading frame，ORF）[13]，具有马铃薯Y 病毒属特征，是马铃薯Y 病毒属的一个独特成员[14]。史跃伟等[15]通过RT-PCR 的方法获得了贵州烟草花叶病毒CP基因，该基因全长为507 bp，并利用原核表达技术表达了贵州烟草花叶病毒CP 蛋白，为后期单克隆抗体的制备奠定了基础。烟草花叶病毒南瓜分离物CP基因与GenBank 上其他TMV 分离物CP基因核苷酸序列的同源性为86.5%～99.0%，推导的氨基酸序列同源性为93.7%～99.4%，烟草花叶病毒南瓜分离物CP基因与原核表达载体pET-22b（+）连接，在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS 诱导表达出相对分子质量约20 000 的融合蛋白[15]。云南5个不同地区烟草花叶病毒CP基因均为480 个碱基，编码 159 个氨基酸，与TMV-U1、P、B 株和福建分离物有较高的同源率（90%以上），而与TMV 中国株系的同源率较低（70%～80%），与TMV 中国株应属于同种病毒不同的株系[16]。李凡等[17]的研究结果也证实了这一观点，再次确认烟草花叶病毒云南分离物CP基因为480 个碱基，编码159 个氨基酸，并指出烟草花叶病毒云南分离物CP基因与T MV-U1 株系和TMV 韩国普通株系核苷酸同源性均为100%。但也有研究表明，云南烟草花叶病毒CP基因含477 个核苷酸，编码159 个氨基酸[18]。本实验结果也表明，广丰千金薯烟草花叶病毒CP基因cDNA 总长度为480 bp，编码159 个氨基酸组成，与烟草花叶病毒CP基因亲缘关系较近。

烟草花叶病毒的致病性是由CP基因及3’端非编码区以外的基因（如MP基因、复制酶基因等）决定的。烟草花叶病毒MP基因决定植物病毒在寄主植物细胞间的移动从而可决定病毒对寄主的侵染性。有研究表明，烟草花叶病毒蚕豆分离MP基因由807 个核苷酸组成，编码268 个氛基酸，烟草花叶病毒的MP基因在不同株系中非常保守，同源性极高[19]。王得元等[20]对广东烟草花叶病毒MP基因进行PCR 扩增，获得了一条0.8 kb的特异扩增产物，与已发表的TMVMP基因编码区803 bp 大小相近。余晓红等[21]克隆了烟草花叶病毒MP基因，发现MP基因含有1 个507 bp 的阅读框架，编码268 个氨基酸，与国外发表的TMVU1 株运动蛋白基因cDNA 的核昔酸序列及推导的氨基酸序列相比，同源率均高达98 以上，再次表明烟草花叶病毒MP基因在同一病毒的不同株系中是相当保守的。本实验结果表明，广丰千金薯烟草花叶病毒MP基因的cDNA 总长度为807 bp，编码268 个氨基酸，与烟草花叶病毒MP基因亲缘关系较近。

因此，广丰千金薯烟草花叶病毒与烟草花叶病毒的亲缘关系较近，同源性在99%以上。表明广丰千金薯烟草花叶病毒不属于马铃薯Y 病毒属，与烟草花叶病毒同源性极高，氨基酸序列及核酸序列与烟草花叶病毒其他植物分离物相似度高，在进化上高度保守。因此，可以利用烟草花叶病毒基因序列来进行广丰千金薯烟草花叶病毒的种类鉴别。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突