胃癌组织Keap-1、Nrf2蛋白表达及与患者远期生存的关系

张剑锋 肖南平 蒋丽琳

我国胃癌的发病率和死亡率均较高[1],患者早期无明显症状,随着病情的发展可出现消化不良等胃部不适症状,晚期会出现呕吐、黑便、疼痛、腹部肿块及盆腔或远处淋巴结转移等体征[2]。临床针对胃癌患者常采取以手术切除为主的综合治疗方式,虽然有效延长了患者的生存期,但远期生存效果仍较差,相关数据显示胃癌患者外科手术后的5年生存率约为21%～30%[3],因此,对胃癌患者远期生存影响因素的探讨具有重要意义。部分研究发现,胃癌的发生、发展与多条信号通路调控改变相关[4,5]。Kelch样环氧氟丙烷相关蛋白-1(Keap-1)是体内各信号通路中一种非常重要的调节蛋白,可以与靶标蛋白特异性结合[6]。有关研究报道,Keap-1在腺瘤及腺癌组织中高表达,并与腺癌的浸润程度及分化程度相关[7]。此外,核因子E2相关因子2(Nrf2)介导细胞的抗氧化反应,与疾病的发生关系密切[8],并在耿文静等[9]的研究中,Nrf2过表达可以促进子宫内膜腺样腺癌的发生、发展和转移。以上研究均提示Keap-1、Nrf2蛋白表达可能参与癌症的发生发展,但此二者是否与胃癌患者术后远期生存相关尚有待进一步分析。鉴于此,本研究特对胃癌组织Keap-1、Nrf2蛋白表达与患者远期生存的关系展开探讨,以期为临床治疗与防控提供指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2015年1月至2017年2月在本院行根治性手术治疗的147例胃癌患者临床资料,其中男83例,女64例;年龄37～78岁,平均年龄(55.33±10.23)岁;体重指数(BMI)为(21.09±1.39)kg/m2;组织分化:低分化50例,中高分化97例。TNM分期:Ⅰ期33例,Ⅱ期40例,Ⅲ期54例,Ⅳ期20例;组织类型:鳞癌24例,腺癌123例;伴淋巴结转移98例;术后辅助化疗73例。本研究经伦理委员会批准,患者及其家属均知情同意。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准:①术前行胃镜及病理学检查确诊为胃癌;②初治,均符合根治性手术适应症,并接受根治性手术+淋巴结清扫术;③术前均未进行放化疗、靶向治疗。④术中均留取患者胃癌组织和癌旁正常组织(距癌≥5 cm),并放置于液氮中保存;⑤临床资料保存完整,且有随访记录。

1.2.2 排除标准:①术前检查及术中发现肿瘤远处转移,手术未达到根治性切除;②残胃癌;③合并心、肝、肾等严重脏器功能障碍;④合并免疫系统疾病者;⑤合并其他恶性肿瘤;⑥伴脑血管疾病、内分泌疾病。

1.3 方法

1.3.1 主要试剂与仪器:组织包埋仪(LEUKA FG1150H)、全自动组织脱水仪(LEIKA TP1020)、冷冻切片机(LEICA CM1950,德国),DML型倒置显微镜(德国Leica公司);Keap1(1∶100)兔抗人多克隆抗体购自福州迈新生物科技开发有限公司;Nrf2(1∶150)兔抗人多克隆抗体购自Santa Cruz公司;磷酸盐(PBS)缓冲液、抗原修复液、通用型二抗、二氨基联苯胺(DAB)显色剂、苏木素染色液购自福州迈新公司。

1.3.2 组织Keap-1、Nrf2蛋白表达检测:采用免疫组化法检测患者胃癌组织和癌旁正常组织中Keap-1、Nrf2蛋白表达。将术中留取的胃癌组织与癌旁正常组织放入10%中性甲醛固定,石蜡包埋,3 μm切片,二甲苯脱蜡,梯度乙醇浸泡,微波抗原修复,血清抗原修复,滴加兔抗人Keap1、Nrf2一抗(Keap1兔抗人多克隆抗体,稀释比为1∶100;Nrf2兔抗人多克隆抗体,稀释比为1∶150),4℃冷藏过夜,次日PBS漂洗10 min,共3次。滴加通用型二抗50 μl,37℃反应2 h后,PBS漂洗10 min,共3次,随后通过DAB进行显色,时长为3 min,苏木素复染30 s,脱水,75%甘油封片。在400倍光学显微镜下观察组织中Keap1、Nrf2蛋白表达,每张切片随机采集6个图像,并通过南京大学捷达80i病理图像分析系统进行计算机图像采集和分析。Keap-1以细胞质染成棕黄色为阳性,Nrf2以细胞质或细胞核染成棕黄色为阳性。①根据染色细胞占比结果记分,占比≤5%计0分,占比>5%但≤25%计1分,占比>25%但≤50%计2分,占比>50%但≤75%计3分,占比>75%计4分;②依据染色细胞显色深浅记分,细胞无显色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。总积分值=A×B,当A×B=0时为阴性,A×B≥1均为阳性。

1.3.3 随访与分组:术后对患者进行为期5年的跟踪随访,并以患者死亡为随访终点,通过门诊复查、电话/微信回访或家庭访视等形式记录患者远期生存情况。将随访期间死亡的患者归为死亡组,另将生存的患者归为生存组。

1.3.4 术后远期生存的影响因素分析:整理可能影响胃癌患者根治性术后远期生存的相关因素,如年龄、性别、BMI、肿瘤大小、病灶部位、组织类型、分化程度、TNM分期、手术方式、淋巴结转移、术后辅助化疗、Keap-1蛋白表达、Nrf2蛋白表达,将其作为自变量,另将远期生存不良作为因变量,对变量进行赋值。见表1。

表1 变量赋值

1.4 观察指标 (1)比较患者胃癌组织与相应癌旁正常组织中Keap-1、Nrf2蛋白表达情况;(2)比较胃癌组织Keap-1、Nrf2蛋白表达阳性者与表达阴性者的中位生存时间;(3)比较生存组和死亡组胃癌组织中Keap-1、Nrf2蛋白表达;(4)胃癌患者远期生存的影响因素:比值比(OR)、95%可信区间(95%CI)。

2 结果

2.1 胃癌组织与相应癌旁正常组织Keap-1、Nrf2蛋白表达比较 胃癌组织中Keap-1、Nrf2蛋白阳性表达率均高于癌旁正常组织(P<0.05)。见表2,图1。

图1 胃癌组织与相应癌旁正常组织Keap-1,Nrf2蛋白表达(免疫组化×400);A Nrf2蛋白在胃癌组织中阳性表达;B Nrf2蛋白在癌旁正常组织中阴性表达;C Keap-1蛋白在胃癌组织中阳性表达;D Keap-1蛋白在癌旁正常组织中阴性表达

表2 胃癌组织与相应癌旁正常组织Keap-1、Nrf2蛋白表达比较 n=147,例(%)

2.2 胃癌组织Keap-1、Nrf2蛋白阳性表达者与阴性表达者的中位生存时间比较 147例胃癌患者术后5年随访期间,均无失访,其中患者死亡109例,生存38例,生存率25.85%。经Kaplan-Meier生存曲线分析显示,Keap-1蛋白阳性表达患者中位生存期低于Keap-1蛋白阴性表达患者(Log-rank =31.3241,P<0.001);Nrf2蛋白阳性表达患者中位生存期低于Nrf2蛋白阴性表达患者(Log-rank =24.358,P<0.001)。见图2。

图2 胃癌组织Keap-1、Nrf2蛋白阳性表达者与阴性表达者生存曲线

2.3 生存组和死亡组Keap-1、Nrf2蛋白表达比较 死亡组患者胃癌组织中的Keap-1、Nrf2蛋白阳性表达率均高于生存组(P<0.05)。见表3。

表3 生存组和死亡组Keap-1、Nrf2蛋白表达比较 例(%)

2.4 胃癌患者远期生存的影响因素 死亡组肿瘤≥4.5 cm、低分化程度、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移、术后辅助化疗占比均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);并经Cox比例风险回归模型分析,肿瘤≥4.5 cm、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、低分化程度、淋巴结转移、术后未辅助化疗、Keap-1、Nrf2蛋白阳性表达均是影响胃癌患者远期生存的危险因素(P<0.05)。见表4、5。

表4 死亡组和生存组远期影响因素比较

表5 Cox回归模型分析

3 讨论

胃癌作为严重威胁人类健康的一种恶性肿瘤,是由多种因素所导致的,其中最主要的原因有幽门螺旋杆菌的感染、遗传、基因以及不良生活习惯等[10]。根治性手术方式是临床治疗胃癌的主要手段,且近年来逐步开展的术前新辅助化疗及免疫治疗等综合治疗,从根本上改变了传统的治疗方式,使胃癌的总体疗效明显提高,但远期生存疗效仍不佳[11]。

本研究结果显示,胃癌组织Keap-1、Nrf2蛋白阳性表达率均高于癌旁正常组织,提示Keap-1、Nrf2蛋白表达可能与胃癌发生有关。正常生理状态下,Nrf2与Keap-1处于分子伴侣形式,而Keap-1作为负调控蛋白可以通过泛素蛋白酶体降解Nrf2,使其维持在较低水平。但由于氧化应激在肿瘤的发生、发展中起着重要作用[12],受其影响,Keap-1结构发生变化,与Nrf2迅速解离,并丧失对Nrf2的负性调节作用,同时反应性半胱氨酸残基发生改变,降低了E3连接酶活性,导致Nrf2磷酸化,使其进入细胞核内并逐渐累积,呈现高表达[13]。有研究发现,Nrf2过度激活会增强细胞和组织的抗氧化能力,保护肿瘤细胞,促进肿瘤的发生、发展[14]。另Keap-1结构发生变化会导致其功能丧失,影响对Nrf2的抑制活性,增强了肿瘤细胞的生存率,并在有关研究中,Keap-1蛋白高表达与结直肠癌的发生、发展有关[15],也表明Keap-1蛋白表达与癌变的发生有关,与本研究结果相似。

本研究中,经Kaplan-Meier生存曲线分析显示,Keap-1蛋白阳性表达患者中位生存期低于Keap-1蛋白阴性表达患者,Nrf2蛋白阳性表达患者中位生存期低于Nrf2蛋白阴性表达患者,且死亡组患者胃癌组织中的Keap-1、Nrf2蛋白阳性表达率均高于生存组,经Cox比例风险回归模型分析,Keap-1、Nrf2蛋白阳性表达均是影响胃癌患者远期生存的危险因素,表明Keap-1、Nrf2蛋白的异常表达与胃癌患者远期生存具有一定联系。国外研究发现,肿瘤的发生、发展与肿瘤干细胞具有密切联系,胃癌发生部位与胃癌干细胞定居部位一致,并具有许多共同特性,提示胃癌可能是一种干细胞疾病[16]。而Nrf2-NQO1信号通路在胃癌干细胞氧化应激反应中发挥了重要作用,激活该通路,可以诱导Nrf2的高表达,进而促进NQO1的表达,增强细胞对氧化应激反应的耐受性,起到细胞保护作用[17]。且癌组织中Nrf2高表达可能是基因突变的结果,此时核内转位异常,Ⅱ相解毒酶基因不能有效激活,氧化应激源的细胞毒性加重,导致细胞功能障碍、凋亡甚至死亡,从而促进肿瘤的发生、发展,加重病情,影响远期生存[18]。Keap-1蛋白结构发生变化,部分功能丧失,对Nrf2的抑制活性降低,使Nrf2持续异常激活,导致其下游亲电药物解毒途径的活性增强,促使肿瘤细胞转移、增殖,并且机体对化疗药物产生耐药性,影响化疗效果[19];此外,也有研究表明,Nrf2蛋白阳性表达与胃癌的侵袭呈正相关,与辅助化疗的耐药性密切相关,可以作为患者预后不良的潜在指标[20]。另Keap-1还可以调控NF-κB信号通路,参与胃癌的发生、发展[21]。并在李璐等[22]的研究中,Keap-1、Nrf2蛋白阳性表达可以影响肺癌患者的预后。而在银萍等[23]的研究中,Keap-1、Nrf2蛋白阳性表达与子宫颈病变患者预后有关,以上均表明了Keap-1、Nrf2蛋白表达与癌变患者的远期生存具有一定联系。

此外,本研究还发现,肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、TNM分期、术后辅助化疗也是影响胃癌患者远期生存的影响因素,与既往研究[24]一致,分析原因:患者肿瘤越大,对胃壁的侵犯越广,手术彻底根治的难度增加,术后复发的风险提升,同时癌细胞更易侵犯淋巴管,导致淋巴结转移的可能性增加,预后较差,从而影响患者远期生存状况;当患者分化程度较低时,具有较明显的细胞异型性,生物恶性程度较高,侵袭性强,多引起早期局部淋巴结或远处转移,而淋巴结转移会增加患者术后发生肿瘤局部残留和远处微转移灶的几率,进而影响患者远期生存;此外,TNM分期可以反应肿瘤的进展状况,当TNM分期较高时,患者肿瘤浸润浆膜后癌细胞极易脱落并造成腹腔种植散播,不利于预后,影响远期生存;另外胃癌患者术后辅助化疗不仅可以巩固手术疗效,并且对术区切除不完全病灶、微转移灶均有抑制作用,故术后辅助化疗可以改善患者远期生存情况。

综上所述,胃癌组织中Keap-1、Nrf2蛋白表达失衡对胃癌患者的远期生存具有一定影响,而对二者的调控是否可能成为胃癌患者远期生存治疗一个新方向,值得进一步的探究。此外,肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、TNM分期也是胃癌患者远期生存的影响因素,临床可采取针对性措施,进行有效的防治。