桂花OfABFs基因克隆和表达分析

洪方蕾，陆 瑶，俞世姣，胡芷诺，缪云锋，钟诗蔚，赵宏波

（1.浙江农林大学 浙江省园林植物种质创新与利用重点实验室，浙江 杭州 311300；2.浙江农林大学 南方园林植物种质创新与利用国家林业和草原局重点实验室，浙江 杭州 311300；3.浙江农林大学 风景园林与建筑学院，浙江 杭州 311300）

bZIP 转录因子家族是植物中最大、最保守且功能最多样的基因家族之一，广泛参与调节多种生物学过程[1-2]。ABF (ABRE binding factor)转录因子属于bZIP 基因家族的A 亚族[3]，特异存在于植物中，ABFs 是ABA 信号转导途径的关键基因，能够特异识别ABA 响应元件(ABA-responsive element，AREB)，并通过与AREB 结合参与下游响应ABA 信号靶基因的调控[4]。月季Rosachinensis中RhABF2 基因能够与含有ABRE 元件的RhFer1 启动子结合，共同调节铁平衡参与调控花瓣衰老过程[5]；睡莲NymphaeacoloratabZIP 家族A 亚组的11 个成员的启动子区域有大量ABA 响应元件，在ABA 信号转导中具有重要作用[6]；菊花Chrysanthemum×morifolium中锌指蛋白BBX19 和ABF3 互作，通过诱导ABA 响应基因表达来调控菊花的耐旱性[7]。桂花Osmanthusfragrans属于木犀科Oleaceae 木犀属Osmanthus常绿乔木，是中国传统十大名花之一。温度、湿度是影响桂花花开放的重要因素。为了解ABFs 转录因子在桂花中的作用，本研究以秋桂品种‘堰虹桂’O.fragrans‘Yanhonggui’为材料，在桂花基因组中筛选出相关OfABFs 基因序列，通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析OfABFs 基因在‘堰虹桂’不同组织和花开放进程中的时空表达模式，为后续阐明ABFs 基因家族各成员的生物学功能提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

以浙江农林大学桂花资源圃的桂花品种‘堰虹桂’盆栽植物为材料，选取株龄相同、长势一致的健康植株，分别于起始1 期(圆珠期前3 d，B1)，起始2 期(圆珠期前2 d，B2)，起始3 期(圆珠期前1 d，B3)，圆珠期(S1)，顶壳期(S2)，铃梗期(S3)，初开期(S4)，盛开期(S5)，盛开末期(S6)，衰老期(S7)共10 个时期进行取样(图1)[8]。同样，取桂花不同组织的样品，包括根、新叶、新枝、老叶、老枝、盛开期的花朵，每个时期样品采集3 份，液氮速冻后储藏于-80 ℃冰箱。

图1 桂花花开放各时期表型图Figure 1 Phenotypic of O. fragrans in different periods

1.2 方法

1.2.1 桂花OfABFs 转录因子鉴定及简单克隆 桂花核苷酸序列来源于桂花基因组数据库[9]，从拟南芥Arabidopsisthaliana信息资源(TAIR) 数据库(http://www.arabidopsis.org/) 和PlantTFDB (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/blast.php)数据库中获得拟南芥的ABFs 氨基酸序列，以此作为查询对象，使用NCBI-Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在桂花基因组蛋白数据库中进行同源比对，确定桂花中的ABFs 基因序列。利用NCBI-CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)对OfABFs 进行保守功能域预测。使用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)分析OfABFs 蛋白结构域。

RNA 的提取使用RNA prep Pure Plant Plus Kit 提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]，使用核酸分析仪(赛默飞世尔科技公司)对RNA 的纯度与浓度进行检测，并用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性。使用HiScriptⅡ Q Select RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒(南京诺维赞生物科技股份公司)，对花开放不同时期的cDNA 进行合成。

运用Primer 5.0 进行简单克隆引物设计(表1)，以花开放时期的花芽cDNA 为模板进行PCR 扩增。PCR 反应体系(20 μL)：上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、cDNA 模板1 μL、GreenTaqMix10 μL和ddH2O 7 μL。PCR 扩增程序：预变性95 ℃，3 min；变性95 ℃，15 s，退火温度以各自引物最佳温度为准，15 s，延伸72 ℃，3 min，35 个循环；72 ℃延伸5 min。将PCR 反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段回收纯化后与pMD-18T 载体连接，连接产物转化大肠埃希菌EscherichiacoliDH5α 感受态细胞，PCR 初步鉴定阳性克隆后送杭州有康生物科技有限公司测序，经比对后确定序列。

表1 桂花OfABFs 简单克隆引物Table 1 Primers for Cloning of OfABFs in O. fragrans

1.2.2 桂花OfABFs 基因染色体定位分析 利用TBtools[10]从桂花基因组Gff 文件中提取桂花OfABFs 基因的染色体位置信息，通过在线分析工具TBtools 进行绘图可视化。

1.2.3 桂花OfABFs 转录因子结构分析 用DNAMAN 对已筛选的桂花OfABFs 转录因子进行氨基酸序列比对，分析其保守结构域和氨基酸序列同源性；通过在线分析软件MEME 5.1.0 分析ABFs 的保守基序(http://meme-suite.org/tools/meme)，并用TBtools 对其进行绘图和可视化。对桂花OfABFs 二级结构特征采用在线软件SOPMA (https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-sopma.html)进行预测分析；使用在线网站Swiss-Model (https://swissmodel.expasy.org/)构建OfABFs 蛋白的三级结构模型。

1.2.4 桂花OfABFs 转录因子蛋白质理化性质分析及亚细胞定位预测 运用ExPASy 在线软件(http://web.expasy.org/protparam/)对OfABFs 进行蛋白质、分子量、理论电点、酸碱性等预测分析和编码；利用SignalP 4.1 Server 分析桂花OfABFs 蛋白有无信号肽。亚细胞定位预测通过在线工具wolfpsort(https:// wolfpsort.hgc.jp/)完成。

1.2.5 桂花OfABFs 转录因子系统进化树构建 从美国国家生物信息中心(NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov)中获取拟南芥、烟草Nicotianatabacum、水稻Oryzasativa、大麦Hordeumvulgare、小麦Triticumaestivum、番茄Solanumlycopersicum、油橄榄Oleaeuropaea的ABFs 氨基酸序列，使用MEGA 11.0 软件进行同源聚类，建立系统发育树并选择Bootstrap (1 000 次)评估检测系统进化树。

1.2.6 桂花OfABFs 转录因子的表达分析 利用Primer Premier 5.0 对5 个OfABFs基因进行荧光定量特异性引物设计(表2)，桂花OfACT作为内参基因[11]，以‘堰虹桂’不同组织及不同花开放时期的花芽cDNA 为模板进行RT-qPCR 扩增。反应体系为20 μL：cDNA 模板2 μL，2×TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。RT-qPCR 程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 个循环；然后以95 ℃持续15 s，60 ℃持续1 min，95 ℃持续15 s 作为熔解曲线分析程序。每个样品设置3 次重复。

表2 桂花OfABFs 转录因子RT-qPCR 特异性引物Table 2 Specific primers for RT-qPCR of OfABFs in O. fragrans

2 结果与分析

2.1 桂花OfABFs 转录因子鉴定及克隆

通过对桂花基因组数据分析，得到5 条OfABFs基因序列，依次命名为OfABF1、OfABF2、OfABF3、OfABF4、OfABF6。用‘堰虹桂’花开放时期的花芽(混样) cDNA 为模板进行PCR 扩增(图2)。结果显示：OfABFs的开放阅读框(ORF) 长度为1 329～1 572 bp，编码442～523 个氨基酸；其中基因OfABF4 氨基酸序列最长，编码523 个氨基酸；基因OfABF6 的氨基酸序列最短，编码442 个氨基酸。

图2 桂花OfABFs 基因片段PCR 扩增Figure 2 PCR amplification of OfABFs of O. fragrans

2.2 桂花OfABFs 基因家族染色体定位分析

根据‘堰虹桂’基因组Gff 文件定位5 个OfABFs 基因。结果显示：5 个桂花OfABFs 基因分布在5 条染色体上，且各个基因在染色体上分布的数量相等，1 号、6 号、11 号、12 号和22 号染色体上各分布1 个OfABF 基因(图3)。

图3 桂花OfABFs 基因家族染色体定位分析Figure 3 Chromosome location analysis of OfABFs genes in O.fragrans

2.3 桂花OfABFs 转录因子结构分析

利用SMART 在线分析软件对桂花OfABFs 进行功能结构域预测。结果显示：5 个桂花ABFs 均含有BRLZ 结构域(图4)。BRLZ 结构域是bZIP 家族特有的保守域，由碱性区和亮氨酸拉链区组成，能够识别特定的DNA 序列，以二聚体形式发挥功能[12]。通过DNAMAN 软件，将OfABFs 氨基酸序列进行比对(图5)。结果显示：OfABF3 和OfABF4 同源性最高，OfABF1 和OfABF6 同源性最低；5 个C 端均含有能被激酶识别的保守序列RXXS/T。

图4 桂花OfABFs 功能结构域分析Figure 4 Functional domains of OfABFs in O. fragrans

图5 桂花OfABFs 转录因子氨基酸序列比对Figure 5 Sequence alignment of OfABFs transcription factor in O. fragrans

对桂花ABFs 氨基酸序列进行保守基序分析发现(图6)：OfABFs 蛋白结构域中含有10 个蛋白基序(Motif 1～Motif 10)，其中Motif 7 在除OfABF4 外的4 个蛋白中均被鉴定到，Motif 8 在除OfABF6 外的4 个蛋白中均被鉴定到，其余8 个Motif 高度保守，是OfABFs 核心结构域的组成部分。

图6 桂花OfABFs 蛋白质保守结构域Figure 6 Conserved motifs OfABFs proteins in O. fragrans

桂花OfABFs 蛋白的二级结构预测表明：桂花OfABFs 蛋白的二级结构均含有α-螺旋、β-折叠、延伸链、无规则卷曲，不同结构占比从大到小依次为无规则卷曲、α-螺旋、延伸链、β-折叠。其中，β-折叠占比最小，均在5% 以下；延伸链占比为10%～13%；α-螺旋和无规则卷曲占二级结构总量的83%，为OfABFs 蛋白二级结构的主要构成元件(表3)。

表3 桂花OfABFs 蛋白二级结构分析Table 3 Secondary structure analysis of protein OfABFs in O. fragrans

桂花OfABFs 蛋白三级结构分析显示(图7)：OfABFs 蛋白三级结构均含丰富的α-螺旋和无规则卷曲，这与其二级结构预测结果一致。含无规则卷曲较多的蛋白稳定性要低于含α-螺旋、β-折叠多的蛋白，在OfABFs 蛋白中无规则卷曲比例均高于50%，为不稳定蛋白，这与其理化性质分析预测结果一致(表3)。

图7 桂花OfABFs 蛋白三级结构预测Figure 7 Prediction of tertiary structure of the OfABFs protein in O.fragrans

2.4 桂花OfABFs 转录因子蛋白理化性质分析及亚细胞定位预测

对桂花ABFs 家族蛋白理化性质的分析结果表明：桂花氨基酸长度为450～523 个，相对分子质量为25.7～56.2 kDa，理论等电点为4.77～10.03，编码氨基酸序列最长的的是OfABF4，其相对分子质量最大，为56.2 kDa；编码氨基酸序列最短的是OfABF2，其相对分子质量也最小，为25.6 kDa。5 个OfABFs基因成员的不稳定系数为46.76～54.43。如果将不稳定系数＞40 的蛋白判断为不稳定蛋白，那么5 个基因的蛋白不稳定系数均高于40，均为不稳定蛋白。桂花ABFs 蛋白脂溶性系数为65.29～78.07，亲水性总平均系数为-0.659～-0.482，均小于0，为亲水性蛋白。信号肽分析结果显示：桂花ABFs 编码蛋白均不含有信号肽，表明桂花ABFs 家族蛋白均非分泌蛋白。亚细胞定位预测发现(表4)：5 个编码蛋白均定位在细胞核，这与其作为转录因子的生物学功能相吻合。

表4 桂花OfABFs 蛋白理化性质分析Table 4 Physicochemical properties of OfABFs proteins of O. fragrans

2.5 桂花OfABFs 转录因子多序列比对和进化分析

构建系统进化树进一步研究OfABFs 的进化关系，结果表明(图8)：8 个物种的25 条氨基酸序列可分为5 个分支(分支Ⅰ～Ⅴ)，其中OfABFs 分布在2 个分支中。OfABF1、OfABF3 和OfABF4 均分布在分支Ⅰ，该分支包括油橄榄OeTRAB1、烟草NtABF2、马铃薯SolanumtuberosumStABF、马铃薯StABF1、番茄SlAREB1 和拟南芥AtABF2，说明OfABF1、OfABF3 和OfABF4 在进化过程中与这些物种亲缘关系较近；OfABF2 和OfABF6 与番茄SlABF4 聚为分支Ⅱ。

图8 桂花OfABFs 与各物种ABFs 转录因子进化分析Figure 8 Studies on the relationship between O. fragrans OfABFs and the evolution of ABFs transcription factors in different species

2.6 桂花OfABFs 转录因子在不同组织和花开放时期的表达分析

利用荧光定量分析5 个基因在根、嫩枝、老枝、新叶、老叶等不同组织中的表达情况。定量结果(图9)显示：OfABF1 在花中表达量最高，在老叶和新叶中表达没有显著差异，在新枝和老枝中相对表达量最低；OfABF2 在老叶中表达最高，其次为新叶，在花中表达略高于枝；OfABF3 在叶中表达水平相对其他组织高，在花和枝中表达较低。OfABF4 在花中相对表达量最高，其次是新叶和老叶，老枝中表达量最低，OfABF6 的相对表达量在花中最高，在其他组织中的表达量均较低。OfABF1、OfABF4、OfABF6 在所有组织中均有表达，但在花中的相对表达水平最高，尤其是OfABF6。

图9 5 个OfABFs 基因在不同组织的表达结果Figure 9 Expression results of 5 OfABFs genes in different tissues

由图10可见：起始1 期(B1)到起始3 期(B3)花芽芽体肥大并延伸。圆珠期(S1)到盛开末期(S6)为花开放时期，OfABF1 在顶壳期(S2)被转录激活，表达显著升高，铃梗期(S3)后表达水平虽呈下降趋势，但仍保持较高水平；OfABF2 在起始1 期(B1)到圆珠期(S1)时期几乎不表达，在顶壳期(S2)的表达量到达峰值，且相对表达水平显著高于其他时期；OfABF3 和OfABF4 在花朵衰老期(S7)的相对表达量最高，在盛开末期(S6)的表达量其次，圆珠期(S1)至盛开期(S5)表达趋势变化不显著；OfABF6 的相对表达量在花朵衰老期(S7)最高。由此说明：OfABF1 和OfABF2 可能与桂花花开放进程有关，OfABF3、OfABF4 和OfABF6 可能参与桂花花衰老的调控。

图10 5 个OfABFs 基因在花开放时期的表达结果Figure 10 Express an results of 5 OfABFs genes in different flower opening periods

3 讨论

ABF 转录因子在模式植物拟南芥、烟草以及园艺作物中的研究较多。ABFs 已在拟南芥、烟草、杨树Populus中被鉴定[12-15]。LI 等[16]对29 种陆地植物中的95 种ABFs 蛋白长度、分子量进行分析，发现ABF 的氨基酸长度为254～485 个；分子量为27.81～52.95 kDa。目前，关于桂花OfABFs的研究较少，通过鉴定与分析桂花OfABF 转录因子，可进一步了解桂花OfABFs 的生物学功能及其表达分析。

OfABFs 蛋白的二级结构组成与烟草、睡莲、野菊Chrysanthemumindicum、蓝莓Vacciniumcorymbosum、大豆Glycinemax[6,17-20]等其他物种中的结构相类似，均以α-螺旋和无规则卷曲为主要构成元件，少量β-折叠和延伸链散布于整个多肽链中。说明在基因变异和进化时，虽然基因外显子的数量上发生变化，但仍具有其保守性，这与杨颖等[2]的研究结果基本一致。基于蛋白行使特定功能依赖其三维结构，本研究使用蛋白三级结构预测软件SWISS-MODEL 同源模拟桂花OfABFs 蛋白三级结构，结果显示：OfABF2 与烟草[17]中的同源蛋白质NtABF1、NtABF2 三级结构类似，除OfABF2 蛋白外，其余成员蛋白三级结构在空间结构上相似度较高，进一步说明ABF 蛋白在进化上较保守，具有对植物生长发育的重要功能。序列比对结果显示：5 个OfABFs 的C 端均具有bZIP 转录因子特有的BRLZ 结构域，且含有保守序列RXXS/T，推测OfABFs 转录因子可通过被磷酸化激活，从而结合下游基因启动子区域的ABRE 元件，调控相关下游胁迫响应基因[20-21]。

系统发育结果显示：桂花ABFs 基因家族成员全部分布在以双子叶植物油橄榄、番茄、马铃薯、烟草为主的分支Ⅰ和分支Ⅱ中，无家族成员分布在以单子叶植物小麦、大麦、水稻等为主的分支Ⅲ、分支Ⅳ和分支Ⅴ中。由此推测，桂花ABFs 与双子叶植物亲缘关系较近，与单子叶植物的亲缘关系较远。表明在进化过程中，ABF 在种属间是高度保守的。

根据亲缘关系推测桂花OfABFs 基因功能，如在分支Ⅰ中，OfABF1、OfABF3、OfABF4 与马铃薯StABF、番茄SlAREB1、烟草NtABF2、拟南芥AtAREB1 亲缘性较高。在对环境的胁迫应答过程中，番茄SlAREB1 的过表达可增加物种干旱和盐胁迫耐受性[22]，诱导有机酸积累的变化并参与其合成的基因编码酶的表达[23]；烟草NtABF2 与拟南芥AtAREB1 响应非生物胁迫，前者通过与胁迫响应基因启动子区的ABRE 元件结合相关基因的转录[16,23-24]，后者受ABA 含量等渗透胁迫诱导，作为关键基因参与ABA 信号调控通路以增强物种抗旱性[25]，显著提高ABA 依赖性逆境响应基因的表达水平[25-28]；在分支Ⅱ中，OfABF2、OfABF6 与番茄SlABF4 同源性较高，且SlABF4 作为ABA 响应因子，ABA 通过其对SICOL4 产生负调控作用，使其与下游乙烯通路相关的基因互作[29]，调控乙烯的合成和信号转导进而调控番茄果实的成熟进程[29-30]。由此推测：桂花OfABFs 可以作为ABA 响应因子，参与ABA 信号转导，影响植物整个生长发育过程[31]。牡丹Paeoniasuffruticosa切花保鲜的研究发现：ABA 以诱导乙烯大量合成的方式间接加速牡丹切花的衰老[32]。还有研究发现：在月季花瓣衰老过程中内源ABA 含量迅速上升，促进RhABF2 的表达量上调，从而推测RhABF2 在月季花瓣衰老过程中发挥调节作用[7]。在桂花中OfABF3、OfABF4 和OfABF5 的相对表达量在衰老期急剧上升，推测在桂花花瓣衰老过程中内源ABA 含量上升，OfABF3、OfABF4 和OfABF5 可能参与调节桂花花瓣的衰老。推测OfABFs 基因响应内源ABA，参与桂花衰老的可能性较大。5 个OfABFs 基因在桂花中的功能值得进一步探讨。

4 结论

以桂花品种‘堰虹桂’为材料，在基因组数据库中筛选出相关5 条OfABFs基因序列。生物信息学分析得出：桂花ABFs 蛋白具有亲水性，较不稳定，无信号肽段。其蛋白二、三级结构预测具有相似特性，无规则卷曲和α-螺旋为其结构组成的主要元件；5 条OfABFs基因序列均含有bZIP 转录因子家族保守结构域；亚细胞定位预测表明：5 条OfABFs 编码蛋白均定位在细胞核。荧光定量PCR 结果表明：OfABF1、OfABF2、OfABF3、OfABF4 和OfABF6 在桂花中的表达具有组织特异性，其中OfABF1、OfABF4 和OfABF6 在花中表达较高。OfABF1 在顶壳期(S2)被转录激活，表达显著升高，铃梗期(S3)后表达水平虽呈下降趋势，但仍保持较高水平；OfABF2 在顶壳期(S2)表达量达到峰值，且相对表达水平著显高于其他时期；OfABF3、OfABF4 和OfABF6 在花朵衰老期(S7)的相对表达量最高。推测OfABF1、OfABF2 可能与桂花花开放进程有关，而OfABF3、OfABF4 和OfABF6 响应ABA 参与调控花朵衰老的可能性较大。