加工和消化后蘑菇DNA 提取与分析

程兢业，吴鸿亿，赵 力，王 婧

（重庆三峡学院，重庆 404100）

在我国，误食毒蘑菇而引发的中毒事件时有发生，毒蘑菇在进入食用和消化环节后难以用传统形态学方法辨认，近年来DNA 分子标记技术在真菌物种鉴别中发展迅速，而高质量基因组DNA 提取为其奠定了基础。目前国内外已有一些关于蘑菇基因组DNA 提取方法的报道，但由于蘑菇组织中含有大量的多糖、蛋白质和色素等物质，以及加工和消化过程中DNA 有所降解，导致后续相关分子实验受到影响[1-4]。因此，笔者在前人的研究基础上，采用试剂盒法和CTAB 法提取加工和消化后的蘑菇DNA，且对经典的CTAB 法进行改良，利用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度和PCR 扩增检测DNA 质量，对提取方法、加工方式及消化对DNA 的影响进行初步的研究，同时也为毒蘑菇DNA 的提取提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

食用菌杏鲍菇、香菇购于当地超市。

CTAB 缓冲液（2% CTAB、100 mmol·L-1Tris-HCl、25 mmol·L-1EDTA、1.5 mol·L-1NaCl）；2-巯基乙醇；蛋白酶K（20 mg·mL-1）；RNase A；酚∶氯仿∶异戊醇（25 ∶24 ∶1）；氯仿∶异戊醇（24 ∶1）；胃蛋白酶；甲醇∶氯仿∶水（1.0 ∶2.0 ∶0.8）。

1.2 试验方法

1.2.1 加工方式

加工方式采用炒、水煮、烘干和冻干的方法。①炒：平底锅烧热后倒入食用油将蘑菇炒至熟透。②水煮：水沸腾后放入蘑菇，分别在水中煮至5 min、10 min、15 min、30 min、45 min 和60 min。③烘干：将蘑菇切成薄片，60 ℃烘箱烘干6 ～7 h 备用。④冻干：将蘑菇切成薄片于-80 ℃冰箱放置一晚后真空冷冻干燥48 h，取出密封备用。以上样品均分为两份，一份消化实验备用，一份作为对照。

1.2.2 消化试验

人工胃液配制及消化处理参考GAUSTERER 等的试验[5]。

1.2.3 DNA 提取

本研究参照原有CTAB 法[6-7]，对其进行改良，提高DNA 质量和提取成功率。改良后CTAB 法操作步骤如下。称取1 g 蘑菇组织研磨后放入10 mL 灭菌离心管中，加入5 mL CTAB 缓冲液，500 µL 2-巯基乙醇，80 µL 蛋白酶K，置于65 ℃的恒温水浴锅中消化1 h。取上清液至新的离心管中，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25 ∶24 ∶1）溶液，振荡至乳白色，12 000 r·min-1离心10 min。加入1% RNase A 溶液，37 ℃水浴30 min。加入等体积的氯仿/异戊醇（24 ∶1），振荡至乳白色，12 000 r·min-1离心10 min。取上清液至新的离心管中，加入等体积预冷异丙醇，-20 ℃放置30 min 后12 000 r·min-1离心10 min。弃上清液，加入800 µL 70%乙醇洗涤两次，无水乙醇洗涤一次，弃去乙醇，室温晾干或超净工作台吹干，加入100 µL 灭菌双蒸水，-20 ℃下保存。

真菌基因组DNA 提取试剂盒购自索莱宝生物技术有限公司，具体操作方法参照试剂盒说明书。

1.2.4 DNA 质量分析

（1）紫外检测。取5 μL DNA 样品，加入双蒸水或TE 缓冲液稀释10 倍，利用紫外分光光度计测量DNA 浓度及OD260/OD280。

（2）PCR 扩增。采用引物ITS4/ITS5 和LROR/LR5，PCR 反应体系总体积为20 μL，其中包含2 μL 10×PCR buffer，1.6 μL dNTP（2.5 mmol·L-1），1.2 μL Mg2+（25 mmol·L-1），0.4 μL Taq 酶（2.5 U），上下引物各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 补足至20 μL。PCR 扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，27 次循环；72 ℃延伸10 min。

（3）琼脂糖凝胶电泳检测。取DNA 样品5 μL，6×Loading buffer 1 μL 混匀，在1%的琼脂糖凝胶点样孔中上样，置于0.5×TAE 缓冲液中，120 V 电泳35 min，采用Gel-Pro analyzer 软件拍照并保存。

2 结果与分析

2.1 紫外分析结果

2.1.1 不同提取方法紫外分析结果

3 种方法提取新鲜食用菌基因组DNA 紫外分析结果见表1，试剂盒法、CTAB 法、改良CTAB 法均能提取杏鲍菇和香菇子实体中的DNA，3 种提取方法存在显著性差异（P＜0.05）。改良CTAB 法的OD260/OD280值在1.8 ～2.0，说明蛋白质和酚类物质已去除干净，无RNA 污染，得到的DNA 纯度最好。CTAB 法提取的杏鲍菇OD260/OD280值小于1.8，存在蛋白质和酚类物质，香菇OD260/OD280值大于2.0，存在RNA 污染，且CTAB 法在提取DNA 过程中，出现较多黏稠胶状物质，上清液为黄褐色，抽提后DNA 沉淀仍有色素残留。试剂盒法提取香菇DNA的OD260/OD280值小于1.8，说明受到蛋白质及酚类物质污染较严重。3 种方法相比，改良CTAB 法得到的DNA 浓度较高，其次是CTAB 法，试剂盒法得到的DNA 浓度最低。

表1 3 种方法提取新鲜食用菌基因组DNA 紫外分析结果

2.1.2 加工和胃消化样品紫外分析结果

试剂盒和改良CTAB 两种方法DNA 紫外分析结果见表2 和3，两种方法所提取的除油和未除油样品DNA 浓度均存在显著差异性（P＜0.05），未除油样品DNA 的OD260/OD280值小于1.8，说明蛋白质、酚类污染严重，DNA 溶液中杂质较多。除油后样品DNA 质量有所提高，OD260/OD280值均在1.8 ～2.0，且DNA 浓度高于除油前，浓度达1 339.33 μg·mL-1。因此，可在DNA 提取前对炒制样品对进行预处理以消除样品中油脂对DNA 的影响。改良CTAB 法提取杏鲍菇水煮5 min、10 min 和15 min 之间，45 min 和60 min 之间DNA 浓度变化无显著性差异，消化组样品在水煮5 ～30 min 时DNA 浓度变化无显著性差异。试剂盒法提取的水煮样品中，杏鲍菇水煮15 ～45 min时DNA 浓度无明显变化，其余水煮组内样品浓度均存在差异，浓度由51.67 ～177.67 μg·mL-1逐渐降低至19.67 ～83.33 μg·mL-1。随着水煮时间的延长，水煮样品DNA 浓度整体呈现下降趋势。改良CTAB 法提取的干制样品DNA 存在显著性差异（P＜0.05），烘干样品浓度均大于冻干样品浓度，两种提取方法均表明消化后干制样品DNA 浓度明显低于消化前。

表2 试剂盒法提取样品DNA 紫外分析结果

表3 改良CTAB 法提取样品DNA 紫外分析结果

试剂盒法和改良CTAB 法提取效果比较见图1，两种DNA 提取方法之间存在显著性差异（P＜0.05），改良CTAB 法所提取DNA 浓度均高于试剂盒法，平均浓度达到1 291.05 μg·mL-1，DNA 质量较高，OD值均在1.8 ～2.0。因此所建立的DNA 提取方法用于消化和加工等复杂样品DNA 提取，且可应用于毒蘑菇中毒案例中，提取蘑菇加工样品及胃消化残留物等，对毒蘑菇的中毒与防治具有重大意义。

图1 不同提取方式对加工和消化样品DNA 浓度的影响

2.2 电泳分析结果

采用试剂盒法提取加工和消化样品DNA 电泳结果见图2，新鲜样品DNA 作为对照。DNA 易溶于水，随着高温与水煮时间的延长，很难从水煮样品中提取完整DNA 片段。所有加工样品成功扩增出ITS 片段，消化后水煮杏鲍菇45 min、60 min 和炒制杏鲍菇未能扩增出ITS 片段，消化后杏鲍菇水煮60 min 和未除油未能扩增出LSU 片段。水煮杏鲍菇45 min、水煮香菇30 ～60 min 和消化后炒制香菇LSU 条带较暗，香菇未除油ITS 条带较暗，说明DNA 提取成功但含量较低。对炒制样品进行除油处理后，存在弥散片段，干制样品基因组DNA 片段完整主带清晰，烘干香菇和消化后冻干香菇未能扩增出LSU 片段。所有消化样品条带均变暗，说明与新鲜和加工样品相比，消化样品DNA 有所降解，DNA 得率较低。引物ITS 扩增成功率为86.5%，引物LSU 扩增成功率为84.6%，两种引物结合使用可将扩增成功率提高至88.5%。

图2 两种方法提取加工和消化样品电泳图

新鲜食用菌DNA 作为对照，改良CTAB 法提取加工和消化样品DNA 电泳结果见图2，水煮5 ～10 min样品基因组DNA 条带清晰，消化后水煮样品无完整条带，所有加工样品成功扩增出ITS 和LSU 片段，水煮香菇30 min 的LSU 条带和水煮香菇15 min 的ITS 条带较暗，消化后的水煮香菇5 ～10 min 扩增出ITS 非特异性片段，片段大小在250 bp 左右，消化后水煮杏鲍菇15 min 样品LSU 条带较暗，其余消化后样品均成功扩增出ITS 片段。炒制样品未进行除油处理时基因组DNA 无明显条带，进行除油处理后可见其主带清晰完整，且无拖尾现象。干制样品基因组DNA 主带不完整，存在大量弥散DNA 片段条带。改良CTAB 法提取样品DNA 引物ITS 扩增成功率为86.5%，LSU 扩增成功率为82.7%，两种引物结合使用可将扩增成功率提高至100%，因此可将ITS和LUS 两种引物联合使用以保证PCR 扩增成功率。

3 结论与讨论

由于进入加工和消化阶段的蘑菇很难通过形态学鉴定其物种，对于误食毒蘑菇中毒案例，针对性治疗便难以进行，因此本试验通过研究加工条件和DNA 提取方法，提高DNA 提取成功率，为后续DNA 分子鉴别实验奠定基础。食用菌中含有较多酚类、多糖及色素等物质，这些物质会形成胶黏状物并裹挟着DNA[8]。1995 年Borroso.G.提出了CTAB法，但CTAB 法最早应用于植物基因组DNA 的提取，随后此方法开始应用于蘑菇DNA 的提取。韩利刚等[9]在这种方法的基础上进行改良来提取丝状真菌的DNA 且取得了很好的效果。同年王春晖等[10]将CTAB 法加以改进，使此法更简单、易操作。江玉姬等[11]将CTAB 法与其他方法加以比较，发现CTAB法是一种优良的蘑菇DNA 提取方法，DNA 产量高，多糖和蛋白质含量低，符合分子生物学实验要求。

本试验在对CTAB 法进行改良时，采用加入蛋白酶K 以去除蘑菇组织中的蛋白质，加入2-巯基乙醇以去除多酚类物质，加入RNase A 以去除RNA。由于RNA 酶会影响DNA 质量，于是选择将RNase A 溶液在使用酚/氯仿/异戊醇抽提液抽提一次后加入，在进行第二次抽提时可将RNA 酶一起去除。油脂的存在对DNA 质量存在一定的影响，于是在进行DNA 提取前对炒制样品进行除油处理，所得DNA 质量与除油前相比具有明显的提升。DNA 为水溶性极强的物质，利用水煮的加工方式较难提取完整DNA 片段。本试验设计水煮时间梯度探究水煮时间对DNA 提取的影响，结果显示随着加工时间延长，所得样品DNA 浓度逐渐减少，试剂盒法未能成功提取所有样品DNA，而改良CTAB 法则成功提取所有样品DNA。引物ITS 结合引物LSU 便能将扩增成功率提高至100%，改良CTAB 法能提取水煮5 ～10 min 样品较为完整的DNA 片段。综上所述，改良CTAB 法适用于加工和消化样品高质量DNA 的提取。