UPLC-MS/MS法测定利伐沙班中的基因毒性杂质

侯继鹏，时晓燕，张业华，郝贵周，张贵民（鲁南制药集团股份有限公司，国家手性制药工程技术研究中心，山东 临沂 273400）

利伐沙班为一种高选择性抗凝药物，可直接抑制凝血因子Ⅹa，从而达到抗凝目的。临床上用于降低关节置换术后下肢静脉血栓风险，预防骨科大手术后深静脉血栓形成，提高非瓣膜性心房颤动患者抗凝治疗的临床疗效[1-5]。

利伐沙班的合成工艺主要使用三个起始物料，其中4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮为合成利伐沙班的中心前体，与化合物2-[（2S）-2-环氧乙烷基甲基]-1H-异吲哚-1，3-（2H）-二酮和5-氯噻吩-2-碳酰氯为原料合成利伐沙班[6]。这三个起始物料均含有基因毒性警示结构，具有潜在的基因毒性[7]，它们及其副反应产物可能残留于利伐沙班。目前对于4-（4-氨基苯基）-3-吗啉酮及其副产物杂质、5-氯噻吩-2-碳酰氯及其副产物杂质、2-[（2S）-2-环氧乙烷基甲基]-1H-异吲哚-1，3-（2H）-二酮的研究均已有报道[8-14]，但未见2-[（2S）-2-环氧乙烷基甲基]-1H-异吲哚-1，3-（2H）-二酮副产物杂质（S）-2-（2-羟基-氯丙基）-1H-异吲哚-1，3-二酮的相关研究。

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）定量测定利伐沙班中的基因毒性杂质（S）-2-（2-羟基-氯丙基）-1H-异吲哚-1，3-二酮，根据人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）M7和2020年版《中国药典》9306遗传毒性杂质控制指导原则相关规定[15-16]，基于毒理学关注阈值（TTC）法，控制（S）-2-（2-羟基-氯丙基）-1H-异吲哚-1，3-二酮限度为50 μg·g－1，以保证利伐沙班的用药安全，现报道如下。

1 材料

1.1 仪器

Vanquish TSQ Altis型超高效液相色谱-质谱联用仪（美国Thermo公司）；十万分之一电子天平MS105DU（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药

利伐沙班原料药（山东新时代药业有限公司，含量＞98.0%，批号：595190401、595190402、595190403、59171201、59171202、59171203）；（S）-2-（2-羟基-氯丙基）-1H-异吲哚-1，3-二酮对照品（深圳斯坦德，含量：99.2%，批号：1894253R-YX-01）；甲酸（质谱级，赛默飞世尔科技公司）；乙腈为（质谱级，Merck公司）；水（超纯水，美国Millipore 公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

UPLC系统：色谱柱 Thermo Hypersil Gold C18（2.1 mm×100 mm，3 μm）；以0.1%甲酸为流动相 A，0.1%甲酸乙腈为流动相 B，梯度洗脱（0～10 min，20%～40%B；10～10.1 min，40%～20%B；10.1～15 min，20%B）；流速 0.2 mL·min－1；柱温 25℃；进样量 20 μL。

质谱：离子源为电喷雾电离源（ESI），正离子模式采集；选择多监测模式（MRM），喷雾电压为3500 V，离子传输管温度为320℃；定量监测离子对m/z239.95→186.11，碰撞电压为16.30 V；定性监测离子对m/z239.95→221.97，碰撞电压为10.01 V。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取（S）-2-（2-羟基-氯丙基）-1H-异吲哚-1，3-二酮对照品适量，加25%乙腈溶解并定量稀释制成150 ng·mL－1的溶液，作为对照品储备液；精密量取对照品储备液1 mL，置10 mL量瓶中，用25%乙腈稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。

2.2.2 供试品溶液的配制 精密称取利伐沙班约15 mg，置50 mL量瓶中，依次加乙腈12.5 mL、水3 mL使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。

2.3 专属性

取空白溶液（25%乙腈）、对照品溶液和供试品溶液进样测定，结果见图1。（S）-2-（2-羟基-氯丙基）-1H-异吲哚-1，3-二酮的保留时间为6.667 min。空白溶液及供试品溶液不干扰杂质的测定。

图1 专属性试验色谱图Fig 1 Specific test chromatogram

2.4 线性关系考察

精密量取对照品储备液适量，用25%乙腈分别稀释制成1.50、3.74、7.49、14.98、22.47、29.96 ng·mL－1的对照品溶液进样测定，记录色谱图。以质量浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线方程A＝7.241×104C＋1.778×104，r＝0.9991，表明（S）-2-（2-羟基-氯丙基）-1H-异吲哚-1，3-二酮在1.50～29.96 ng·mL－1内与峰面积线性关系良好。

2.5 定量限和检测限

取对照品储备液，用25%乙腈逐级稀释至信噪比（S/N）约为10，测定定量限；用25%乙腈逐级稀释至S/N约为3，测定检测限。测得（S）-2-（2-羟基-氯丙基）-1H-异吲哚-1，3-二酮的定量限为1.50 ng·mL－1，检测限为0.45 ng·mL－1。

2.6 回收试验

精密称定利伐沙班15 mg，置50 mL量瓶中，依次加乙腈12.5 mL、水3 mL使溶解，共9份，各加入对照品储备液0.5、1、1.5 mL，用水稀释至刻度，摇匀，制成低、中、高浓度的溶液，每个浓度平行制备3份。依法测定，计算平均回收率，结果见表1，表明本方法准确度良好。

表1 回收试验结果Tab 1 Recovery

2.7 精密度、重复性试验

精密量取对照品储备液1 mL，置10 mL量瓶中，加25%乙腈稀释至刻度，摇匀，配制6份，进样测定，计算（S）-2-（2-羟基-氯丙基）-1H-异吲哚-1，3-二酮峰面积的RSD为0.63%（n＝6），表明本方法精密度良好。

精密称取利伐沙班 15 mg，置50 mL量瓶中，依次加乙腈12.5 mL、水3 mL使溶解，加入对照品储备液1 mL，用水稀释至刻度，摇匀，配制6份，进样测定，结果（S）-2-（2-羟基-氯丙基）-1H-异吲哚-1，3-二酮含量的RSD为2.8%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取新配制的对照品溶液，在0、3、6、9、12 h进样测定，记录色谱图。计算得（S）-2-（2-羟基-氯丙基）-1H-异吲哚-1，3-二酮峰面积的RSD为4.3%，表明对照品溶液于室温放置12 h内稳定。

2.9 样品测定

取6批利伐沙班原料药，按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液。精密量取供试品和对照品溶液，分别进样测定。按外标法以峰面积计算6批利伐沙班中（S）-2-（2-羟基-氯丙基）-1H-异吲哚-1，3-二酮的含量，结果6批次利伐沙班中均未检出。

3 讨论

基因毒性杂质由于其毒性相对较高，引起了国内外药物工作者的高度重视，各药品管理机构发布了相应的指导原则，对基因毒性杂质推荐以TTC 1.5 μg·d－1来控制用药风险。基于TTC，根据利伐沙班产品说明书，以使用利伐沙班每日最大口服剂量30 mg·d－1计算，控制（S）-2-（2-羟基-氯丙基）-1H-异吲哚-1，3-二酮的限度须不超过50 μg·g－1。

方法摸索时，根据（S）-2-（2-羟基-氯丙基）-1H-异吲哚-1，3-二酮的结构，选择采用ESI离子源，正离子检测模式，使用三通连接注射泵、超高效液相色谱仪和质谱检测器，调整质谱的参数使杂质的响应达到最大；同时根据仪器优化的离子对，选择m/z239.95 → 186.11为定量离子对，m/z239.95 → 221.97为定性离子对，采用同时进行定性定量的方法提高检测方法的准确度，防止假阳性结果的产生。

应用TTC法计算得到杂质的限度较低，当质谱常规进样量为5 μL时发现，杂质的响应无法达到检测限度要求，故提高进样量至20 μL，使方法满足限度检测要求；但此时系统进样体积较大，而UPLC系统的管路及色谱柱较细，杂质产生较强的溶剂效应，峰形较差。根据流动相中有机相的比例，测试25%、30%、40%乙腈为稀释液发现，使用25%和30%乙腈为稀释液时（S）-2-（2-羟基-氯丙基）-1H-异吲哚-1，3-二酮峰形较好，使用40%乙腈峰形变差，最终选择25%乙腈为稀释液。

利伐沙班在水中溶解性较差，直接使用25%乙腈配制质量浓度为0.3 mg·mL－1的利伐沙班时，供试品无法完全溶解；经摸索发现可以先加部分乙腈和水让利伐沙班原料溶解，然后再加水进行定容，用25%乙腈作为稀释液的配制思路进行供试品的配制。通过加标验证该配制方法杂质回收率较好，解决了原料无法完全溶解的问题。