不同干燥方法对桑叶主要成分和芦丁含量的影响

林伟雄，邓李红，钟志奎，陈仕妍，杨赞，罗毓，张正*，吴晓英（1. 广东一方制药有限公司，广东 佛山 528244；2. 广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244）

桑叶为桑科植物桑Morus albaL.的干燥叶，性味甘、苦、寒，归肺、肝经，具有疏散风热、清肝明目、清肺润燥的功效，主要用于治疗风热感冒、头晕头痛、肺热燥咳、目赤昏花等症[1]。桑叶资源分布广泛，主产于广东、广西、安徽、重庆、云南等地[2]，具有降血糖、调血脂、抗病毒、抗氧化等药理作用[3-6]，含有黄酮类、酚酸类、生物碱类等主要化学成分[2，7-9]。桑叶作为传统大宗中药材，临床应用十分广泛，采收加工方法也丰富多样[10]。历代本草记载，民国以前桑叶加工方法以阴干、炙干为主，阴干、炙干法首次明确记载于宋《本草图经》[11]；民国至今桑叶加工方法则由阴干、炙干转变为晒干，晒干法最早见于清《本经疏证》[12]，被后续本草沿用至今。本研究在测定桑叶指标成分芦丁含量[1]的基础上，建立桑叶药材高效液相色谱特征图谱，通过单因素方差分析和熵权TOPSIS法等对芦丁含量及特征图谱的多指标变量进行统计分析，探究阴干、晒干、烘干3种加工干燥方法对桑叶化学成分的影响，建立科学合理的桑叶加工干燥方法评价体系。

1 材料

1.1 仪器

ARC型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；ME204E型、XP26型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；MiliQ Direct 8型超纯水机（德国默克有限公司）；KQ-500DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；111B型二两装高速中药粉碎机（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）。

1.2 试药

新绿原酸（批号：DSTDX001503，纯度：99.58%）、隐绿原酸（批号：DST220104-035，纯度：99.30%）、芦丁（批号：DST210520-017，纯度：99.19%）（成都乐美天医药科技有限公司）；液相用水为超纯水，甲醇、磷酸为色谱纯，其余试剂为分析纯。

15批桑叶药材（编号1～15）经广东一方制药有限公司孙冬梅教授鉴定为桑科植物桑Morus albaL.的干燥叶，来源信息详见表1。15批桑叶药材，每批均分3份，分别平铺于托盘中，一份于室内阴凉干燥通风处放置阴干，得桑叶阴干饮片（编号Y1～Y15）；一份于室外阳光直射处放置晒干，得桑叶晒干饮片（编号S1～S15）；一份于烘箱内设置55℃烘干，得桑叶烘干饮片（编号H1～H15）。3种干燥方法均是以药典标准水分不超过15%评价为干，并测定各批次药材水分在10%～12%。干燥过程中尽可能确保每种方法不同编号的样品处理一致。

表1 15批桑叶药材来源信息Tab 1 Source information of 15 batches of mulberry leaf

2 特征图谱的建立及分析

2.1 色谱条件

Waters XBridge C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～5 min，15%A；5～20 min，15%～30%A；20～40 min，30%～60%A；40～42 min，60%～15%A；42～47 min，15%A）；检测波长358 nm；流速1.0 mL·min－1；柱温30℃；进样体积10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

取新绿原酸、隐绿原酸和芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含新绿原酸39.04 μg、隐绿原酸24.83 μg和芦丁22.42 μg的混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取阴干、晒干和烘干桑叶样品粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，称定重量，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）45 min，取出冷却，再称定重量，用50%甲醇补量，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 方法学考察

2.4.2 重复性考察 取桑叶供试品粉末约0.5 g，精密称定，平行制备6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以6号峰芦丁为参照峰（S），计算得到各特征峰RRT和RPA的RSD均小于3.0%，提示该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性考察 取桑叶供试品粉末约0.5 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在样品制备后0、2、4、8、12、24 h按照“2.1”项下色谱条件测定，以6号峰芦丁为参照峰（S），计算得到各特征峰RRT和RPA的RSD均小于3.0%，提示供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 HPLC特征图谱的建立及相似度评价

取15批阴干、晒干及烘干桑叶样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，采集15批不同干燥方法桑叶色谱图，将其导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件中进行色谱图匹配，分别以Y1、S1、H1图谱作参照图谱，设置时间窗宽度为0.1 min，经多点校正、全谱峰匹配、中位数法分别生成阴干、晒干及烘干桑叶的共有特征图谱及相应的对照特征图谱，详见图1。15批阴干、晒干及烘干桑叶共有特征图谱中均标定了共有峰7个，通过对照品比对，指认了1号峰为新绿原酸、3号峰为隐绿原酸、6号峰为芦丁，详见图2。计算15批阴干、晒干及烘干桑叶样品特征图谱与各自生成的共有对照特征图谱的相似度，同批次阴干、晒干及烘干样品间的相似度，结果见表2。结果显示相同干燥方法下的不同批次桑叶样品以及不同干燥方法下的同批次桑叶样品间相似度均大于0.95，表明不同批次及不同干燥方法的同批次桑叶样品间的质量一致性较好。

图1 不同干燥方法桑叶共有特征图谱及对照图谱（R）Fig 1 Common characteristic chromatogram and reference characteristic chromatogram（R）by different drying methods of mulberry leaves

图2 混合对照品溶液的HPLC图Fig 2 HPLC chromatogram of mixed reference substances

表2 不同干燥方法桑叶特征图谱的相似度结果Tab 2 Similarity of the characteristic chromatogram of mulberry leaves by different drying methods

2.6 方差分析

采用SPSS 20.0软件对15批阴干、晒干及烘干桑叶共有特征峰的单位峰面积进行单因素方差分析。结果显示，共有峰1～7单位峰面积在阴干、晒干、烘干三者之间差异无统计学意义（P＞0.05），表明不同干燥方法对桑叶化学成分影响较小，但整体上晒干桑叶的峰面积含量优于阴干与烘干桑叶，另烘干桑叶峰1～3的峰面积含量略高于晒干桑叶，而峰4～7的峰面积含量较晒干桑叶则略有下降，提示峰4～7或为热敏成分。15批阴干、晒干及烘干桑叶特征图谱共有峰单位峰面积的方差分析结果见表3。

表3 不同干燥方法桑叶特征图谱共有峰单位峰面积方差分析结果( ±s，n＝15)Tab 3 Variance analysis of common peak area of mulberry leaves by different drying methods ( ±s，n＝15)

表3 不同干燥方法桑叶特征图谱共有峰单位峰面积方差分析结果( ±s，n＝15)Tab 3 Variance analysis of common peak area of mulberry leaves by different drying methods ( ±s，n＝15)

有峰阴干晒干烘干共1 72 501.33±20 315.8076 520.73±24 010.4880 433.20±38 269.91 2 606 934.07±267 044.42646 428.67±253 508.71704 639.40±251 904.10 3 113 813.67±36 594.97123 350.87±44 798.79137 525.93±69 814.66 4 98 114.80±36 159.27102 490.07±40 642.0889 928.13±31 809.23 5 70 214.53±44 972.9881 893.80±54 804.2659 611.60±29 304.11 6 1 015 570.33±409 264.171 180 612.73±426 067.121 116 798.53±376 830.34 7 502 579.27±279 744.76558 532.73±294 685.32495 255.93±203 671.35

2.7 熵权TOPSIS法分析

2.7.1 建立初始决策矩阵 假设样本有m个，指标有n个。各样本（1，2，3…，m）在各指标（1，2，3…，n）下的测量值为Xij，按如下公式计算初始决策矩阵V。

2.7.2 建立标准化决策矩阵 以15批不同干燥方法桑叶特征图谱7个共有特征峰的单位峰面积为高优指标，按如下公式对原始数据进行高优指标同向化处理，计算指标越大越优型Rij，然后进行数据归一化处理。

2.7.3 确定各指标权重 按如下公式计算各评价指标的熵值Ej和权重wj，得到熵值Ej＝（0.9486、0.9437、0.9201、0.9488、0.9100、0.9547、0.9289）；权重wj＝（0.1156、0.1265、0.1795、0.1150、0.2021、0.1017、0.1597）。

2.7.4 建立加权决策矩阵 加权决策矩阵计算公式如下，确定最优向量Z＋＝（Z1＋，Z2＋，…，Zn＋），其中Zj＋＝max（Z1j，Z2j，…，Znj）；最劣向量Z－＝（Z1－，Z2－，…，Zn－），其中Zj－＝min（Z1j，Z2j，…，Znj）。得到Zj＋＝（0.1156、0.1265、0.1795、0.1150、0.2021、0.1017、0.1597）；Zj－均为0。

高校档案馆要想在学校的发展实现自身的价值，就要改变以前封闭的管理体系, 打破部门与部门、学校与学校之间的屏障,在校内和校外两个方向寻求合作, 实现档案信息的流动与共享，不仅将档案信息资源从形成到归档环节进行管理,更要向外延伸兼顾社会需求。

2.7.5 贴近度的计算及评价 按如下计算各批次不同干燥方法桑叶样品中最优向量Z＋和最劣向量Z－的距离D，和各批次不同干燥方法桑叶样品与最佳方案的欧氏贴近度Ci，并进行排名，Ci越大表明越接近最佳方案，结果见表4和图3。

图3 15批不同干燥方法桑叶样品Ci值折线图Fig 3 Ci value fold line diagram of 15 batches of different drying methods of mulberry leaves

表4 15批不同干燥方法桑叶样品质量评价排序Tab 4 Quality evaluation ranking of 15 batches of mulberry leaf samples by different drying methods

结果显示除桑叶药材编号为4、12的同批次阴干、晒干、烘干桑叶样品Ci值几乎重叠外（见图3），其余同批次不同干燥方法制备的桑叶样品Ci值存在差异，且个别批次浮动较大，表明不同干燥方法制备的桑叶样品多数存在一定差异。同批次样品中，最低Ci值晒干桑叶仅占1批，烘干桑叶占6批，阴干桑叶占8批；最高Ci值晒干桑叶占7批，烘干桑叶占6批，阴干桑叶占2批；可知同批次制备的晒干桑叶Ci值整体优于阴干和烘干桑叶，且同批次制备的烘干桑叶最高及最低Ci值浮动较大，同批次制备的阴干桑叶样品Ci值则整体偏低。

3 芦丁的含量测定

3.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇为流动相A，0.5%磷酸为流动相B，梯度洗脱（0～5 min，30%A；5～10 min，30%～35%A；10～15 min，35%～40%A；15～18 min，40%～50%A；18～19 min，50%～30%A；19～30 min，30%A）；检测波长358 nm；流速0.8 mL·min－1；柱温30℃；进样体积10 μL。

3.2 对照品溶液的制备

取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg芦丁的溶液，即得。

3.3 供试品溶液的制备

取阴干、晒干、烘干桑叶样品粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，摇匀，密塞，称定重量，加热回流1.0 h，冷却，再称定重量，用70%甲醇补重，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

3.4 专属性考察

取上述供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液（70%甲醇）各适量，按“3.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果桑叶供试品及对照品色谱图的基线均平稳，芦丁色谱峰分离度、对称性良好，供试品中芦丁色谱峰与对照品色谱峰的保留时间基本相同，且阴性对照无干扰，见图4。

图4 桑叶专属性考察的高效液相色谱图Fig 4 HPLC chromatogram of the virginity exclusive investigation of mulberry leaf

3.5 线性关系考察

取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成含芦丁199.54 μg·mL－1的对照品储备液，分别取芦丁对照品储备液0.2、0.4、1、2、5、10 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得每1 mL含3.99、7.98、19.95、39.91、99.77、199.54 μg芦丁的系列对照品溶液，按“3.1”项下色谱条件检测样品。横坐标为进样质量浓度（μg·mL－1，X），纵坐标为峰面积值（Y），进行线性回归，得回归方程，Y＝2.313×104X＋2.330×104，R2＝0.9992，结果表明芦丁在质量浓度3.99～199.54 μg·mL－1与峰面积值呈良好的线性关系。

3.6 精密度考察

取桑叶样品粉末约0.5 g，精密称定，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件重复检测6次，记录峰面积。结果芦丁峰面积的RSD为0.99%，提示仪器精密度良好。

3.7 重复性考察

取桑叶样品粉末约0.5 g，精密称定，平行制备6份，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件检测，记录峰面积。结果芦丁峰面积的RSD为0.64%，提示该方法重复性良好。

3.8 稳定性考察

取桑叶样品粉末约0.5 g，精密称定，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，分别在样品制备后0、2、4、8、12、24 h，按“3.1”项下色谱条件检测，记录峰面积。结果芦丁峰面积的RSD为0.20%，提示供试品溶液在24 h内稳定。

3.9 加样回收率考察

取含量已知的桑叶样品0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按样品中芦丁含量的50%、100%和150%分别加入相应的对照品，设计3组实验，每组平行3份。按“3.3”项下方法制备供试品溶液，在“3.1”项色谱条件下检测样品，计算得低、中、高浓度水平下芦丁平均加样回收率分别为102.88%、103.56%、100.17%，RSD分别为0.68%、0.42%、0.38%，表明方法准确度良好。

3.10 样品测定

取15批阴干、晒干和烘干桑叶样品粉末约0.5 g，精密称定，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，按照“3.1”项色谱条件测定，结果见表5，同批次样品中，最低芦丁含量阴干桑叶占8批，烘干桑叶占7批；最高芦丁含量晒干桑叶占13批，烘干与阴干桑叶各占1批；可知晒干制备的桑叶样品芦丁含量整体优于阴干和烘干桑叶。

表5 15批不同干燥方法桑叶芦丁含量结果(%)Tab 5 Rutin content of 15 batches of mulberry leaves by different drying methods (%)

4 讨论

本研究通过图谱相似度、方差分析、熵权TOPSIS法对比分析了阴干、晒干、烘干3种干燥方法对桑叶特征图谱共有峰的影响。特征图谱相似度结果表明3种干燥方法制备的桑叶样品相似度均大于0.95，方差分析结果也显示7个共有峰的单位峰面积间差异无统计学意义，表明不同干燥方法桑叶样品间一致性较好，即不同干燥方法对桑叶化学成分影响较小。熵权TOPSIS法通过数据本身的离散性进一步确定了桑叶样品中7个共有峰的权重，根据Ci值对不同干燥方法的桑叶样品进行排序[13]，结果表明不同干燥方法制备的桑叶样品Ci值存在一定差异，晒干桑叶的Ci值整体优于阴干和烘干桑叶，烘干桑叶的Ci值浮动较大，阴干桑叶的Ci值则整体偏低，提示不同干燥方法制备的桑叶样品间化学成分含量差异虽无统计学意义，但晒干桑叶样品质量整体稳定且优于阴干、烘干桑叶样品。另通过测定不同干燥方法的桑叶样品中芦丁含量的结果可知，晒干桑叶样品芦丁含量整体优于阴干和烘干桑叶样品，与熵权TOPSIS法分析结论一致。该方法稳定性及重复性较好，且操作简单，可为桑叶干燥工艺参数进一步研究提供科学合理的评价方法，也可为桑叶资源进一步开发利用提供依据。

5 展望

为保证药食两用桑叶药材的质量和品质，可考虑进一步加强桑叶干燥方法的规范化研究，同时考虑到桑叶中主要含芦丁、绿原酸等具有热敏、易氧化特性的有效成分[2]，在干燥方法选择上应尽量遵循低温、快速原则[14]。传统干燥方法中，阴干干燥方法虽遵循了低温原则，但在长时间阴干过程中，桑叶容易腐烂、变质，失去药用价值和经济价值；现代干燥技术烘干的干燥进程虽快，但也会加速桑叶有效成分的氧化、水解等反应。这可能是本次研究结果中阴干、烘干桑叶样品质量稳定性不如晒干桑叶的主要原因，在桑叶大生产干燥应用中其不稳定性极可能会进一步放大[15-16]，进而造成市场上流通的桑叶质量参差不齐，故在保证桑叶干燥品质的基础上，建议对阴干、晒干、烘干等干燥方法的工艺参数进行更精细的研究，以确保采收加工的桑叶药材质量稳定且均一，从而使桑叶得到更有效的利用。