临床孤立综合征转归多发性硬化的生物标志物分析

梁叶源 张滢 丘小慧 唐玉兰 梁军利

临床孤立综合征(CIS)指单次发作的急性或亚急性中枢神经系统脱髓鞘疾病,持续时间超过24 h[1]。多数CIS患者可出现复发,常转归为多发性硬化(MS),少部分患者转归为视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)等中枢神经系统免疫性疾病[2]。基于CIS和MS治疗策略和预后的差异,从MS发病机制角度探索CIS的转归特点,可能为MS的诊断、预后以及早期干预措施提供依据。近期研究发现,维生素D通过抑制记忆T细胞分化为促炎辅助T细胞1(Th1)和Th17淋巴细胞,减少白细胞介素17A(IL-17A)、IL-23、IL-21、IL-22等因子分泌[1],从而抑制MS等疾病的炎症反应[3]。血清维生素D及其受体(VDR)水平的降低与MS的发病相关[4]。本研究通过分析CIS患者转归MS前后血清维生素D〔25(OH)D2和25(OH)D3〕、VDR水平及血清和脑脊液(CSF)Th17细胞因子水平的变化,旨在探讨其在MS病情演变评估及CIS转归中的作用。

1 对象和方法

1.1 对象纳入2018年1月至2020年11月广西医科大学第一附属医院及广西医科大学第二附属医院神经内科收治的CIS患者74例,其中女54例,男20例,平均年龄(31.64±8.42)岁。纳入标准:(1)符合2017年McDonald诊断标准[5];(2)年龄18～60岁;(3)首次发病急性期(症状开始1周内);(4)发病前1个月内无免疫治疗(包括静脉/口服激素、免疫抑制剂、丙种球蛋白、血浆置换等);(5)水通道蛋白4(AQP4)抗体和抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白免疫球蛋白G(MOG)抗体阴性。排除标准:(1)发病前2个月内补充维生素D;(2)素食者;(3)合并颅内外感染急性期患者;(4)妊娠期及哺乳期妇女;(5)合并其他免疫相关疾病、肿瘤患者。另选取长期居住在南宁及周边的神经系统非炎性疾病(non-inflammatory neurological disease,NIND)住院患者30例(包括紧张型头痛9例,周期性瘫痪21例)作为对照组,其中女19例,男11例,平均年龄(31.17±5.78)岁。对照组排除标准同病例组。两组间性别构成、年龄比较差异无统计学意义。本研究通过广西医科大学第二附属医院伦理委员会审查通过(2019-KY-0004),且入组对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1一般资料收集:记录患者性别、年龄、扩展残疾状况量表评分(expanded disability status scale,EDSS)、影像学资料、血及CSF炎症因子、血清维生素D及VDR水平、治疗及随访转归等资料。比较CIS组和NIND组、CIS转归MS组和未转归MS组、转归MS患者转归前后间细胞因子、维生素D水平等差异,并进一步分析维生素D、VDR、EDSS评分与Th17细胞相关因子的相关性。

1.2.2血及CSF采集:CIS患者于入院第2天(均为急性期未经免疫治疗时)、NIND患者于入院时禁食8 h后于5:00～6:00点晨起采集静脉血5 mL,离心取上清液,置-80 ℃冰箱保存待测。采集外周血同时,进行腰椎穿刺留取CSF 3 mL保存备用。

1.2.3维生素D及VDR检测:采用超高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)分别检测 25(OH)D2和25(OH)D3水平。以25(OH)D2和25(OH)D3含量之和计算维生素D水平。采用ELISA法检测血清VDR水平。所有样品一式两份进行测定,取均值。

1.2.4炎性因子检测:采用全自动酶免仪检测血清及CSF中IL-6、IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23和转化生长因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β)水平。IL-6、IL-21、IL-22、IL-23和TGF-β水平检测的灵敏度为10 pg/mL,IL-17A水平的灵敏度为2 pg/mL。板内、板间变异系数均小于5%。操作步骤严格按试剂盒说明书进行。所有样品一式两份进行测定,取均值。

1.2.5影像学检查:对所有患者进行头和脊髓MRI检查,观察病灶部位、数量、强化情况、脊髓病灶长度。如CIS患者转归为MS时复查头和脊髓MRI。

1.2.6CSF检查:包括白细胞计数、总蛋白、寡克隆带(oligoclonal band,OCB)等。

1.2.7治疗与随访:CIS患者均给予激素治疗(甲泼尼龙0.5 g×3 d、250 mg×3 d静脉滴注,后改为泼尼松口服,1 mg/kg,递减后1个月内停服)。同时给予抑制胃酸、补钾治疗,所有患者未给予补充维生素D治疗,随访期间未给予其他免疫治疗。入组CIS患者每个月电话随访1次,3个月门诊随访1次,出现临床复发为随访终点。由两位资深神经内科医师共同判断患者是否出现临床复发及是否确诊为MS[5]。如出现新发症状或原有症状加重,包括转归为诊断MS的患者,则在1周内按照前文方法进行血清和CSF采集。

1.3 统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行统计分析,符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示,两组间比较采用t检验;计数资料比较采用卡方检验;相关性分析采用Pearson相关系数分析。以P<0.5为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIS和NIND组细胞因子水平比较与NIND组比较,CIS组未治疗前血清维生素D、 25(OH)D2、25(OH)D3、VDR、IL-6以及血清和CSF TGF-β水平均明显降低(均P<0.01),血清和CSF IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23水平增高(均P<0.01)。结果见表1。

表1 CIS和NIND患者基线细胞因子水平比较

2.2 转归与未转归MS组临床特征及CSF检测比较74例CIS患者随访时间6～42个月,中位数为25个月。失访3例,分别于随访9、11、22个月时各失访1例,失访前均未复发。最终共71例CIS患者完成随访,纳入研究。其中转归为MS 43例(60.56%),未转归组28例(39.44%)。与未转归组比较,转归组平均年龄低(P<0.01),CSF白细胞计数增多、总蛋白升高及OCB阳性者比例均高(表2)。

表2 CIS患者转归与未转归MS组间临床特征及CSF检测结果比较

2.3 转归和未转归MS组患者基线细胞因子水平比较转归为MS的CIS患者基线CSF IL-17A、IL-23水平高于未转归组(P<0.01)。见表3。

表3 CIS患者转归与未转归MS组基线细胞因子水平比较

2.4 CIS患者转归MS前后Th17细胞相关因子水平比较与转归前基线水平相比,转归MS后血清IL-17A、IL-23、IL-6水平增高,而TGF-β水平降低(均P<0.05),CSF IL-17A、IL-23、TGF-β水平升高(均P<0.05)。结果见表4。

表4 CIS患者转归为MS前后Th17细胞相关因子水平比较

2.5 维生素D、VDR、EDSS与Th17细胞相关因子的相关性CIS患者EDSS评分与血清IL-17A和IL-21水平呈负相关(P<0.05),与其他细胞因子无相关性。血清维生素D、VDR与血清及CSF IL-6、IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23、TGF-β水平均无相关性(均P>0.05)。结果见表5。

表5 CIS患者维生素D、VDR、EDSS与血清和CSF Th17细胞相关因子的相关性

3 讨论

有研究表明,85%的MS患者首发症状表现为CIS,而约45%的CIS患者2年内将转归为MS,偶有转归为NMOSD者[2]。本研究结果显示,与未转归MS患者比较,转归为MS组CIS患者治疗前CSF IL-17A、IL-23水平均升高,提示CSF IL-17A和IL-23可能是CIS转归为MS的生物标志物;此外,年龄低、CSF细胞数增多、CSF总蛋白增高、OCB阳性对CIS转归为MS有预测价值,这与既往研究结果相似。

近期研究发现,在随访1年期内,转归为MS的CIS患者血清维生素D水平显著低于非转归组,提示低水平维生素D可作为预测CIS转归为MS的独立预测因子[6]。本研究入组患者居住在北纬20°～26°之间亚热带气候,与年龄、性别和长期居住地相匹配的NIND患者比较,CIS患者血清维生素D、VDR水平降低,维生素D的降低主要以25(OH)D3为主,这与Shaheen等[6]研究结果相似。此外,本研究发现转归为MS的CIS患者治疗前维生素D水平较未转归组有降低趋势,尽管两组间比较无统计学差异,亦提示维生素D,尤其是25(OH)D3水平减低可能是CIS转归为MS的重要生物标志物。

研究发现Th17细胞相关的因子在自身免疫性疾病的炎症组织中富集。在MS动物模型中,阻断IL-23或其下游因子IL-17可降低炎症反应,抑制疾病的发展[7]。IL-6、IL-17和TGF-β等炎症细胞因子之间存在复杂的关系网络,共同诱导中枢神经系统炎性反应,与MS发病密切相关[8],但其在CIS发病机制中的研究未见报道。本研究结果显示,与NIND组比较,CIS组治疗前血清维生素D、25(OH)D2、25(OH)D3、VDR、IL-6以及血清和CSF TGF-β水平均明显降低,血清和CSF IL-17A、IL-21、IL-22、IL-23水平增高;进一步研究发现,CIS患者向MS转归的过程中,其血清IL-6、IL-17A、IL-23水平增高,TGF-β水平降低,CSF IL-17A、IL-23、TGF-β水平升高,这与既往研究结果一致[9],提示IL-6、IL-17A、IL-23和TGF-β可能是预测CIS向MS转归的生物标志物,在CIS发病及转归为MS的机制中可能发挥重要作用。

目前,针对MS或CIS患者维生素D与Th17细胞相关因子相关性的研究较少。有研究发现,维生素D能够抑制MS患者单核细胞来源的树突状细胞的分化和成熟,抑制IL-23分泌,最终抑制MS进展和复发[10]。对人外周血单核细胞进行体外培养,加入维生素D 72 h后,培养液上清中IL-17、IL-23和TGF-β水平明显降低,提示维生素D可能减少促炎因子的表达和分泌[11]。本研究未发现CIS患者血清维生素D、VDR与Th17细胞相关因子存在相关性,仅发现患者EDSS评分与血清IL-17A和IL-21水平呈负相关,这与既往多数研究结论并不一致[12]。近年来Hernandez-Ledesma等研究亦发现MS患者维生素D与Th17细胞相关因子水平不存在明显的相关性[13]。作者猜测,导致研究结论不一致的原因可能与样本量较少有关,也可能维生素D和Th17细胞相关因子对MS具有独立的调节作用。

本研究结果显示,转归为MS的患者基线CSF OCB阳性率及细胞计数和总蛋白水平增高患者比例高于未转归组,提示这些指标可能成为预测MS的潜在指标。本研究转归为MS的CIS患者中OCB阳性达72.09%,CSF细胞数和总蛋白均为轻度增高,这与既往研究结果相似[14-15]。其原因可能为在MS患者的慢性淋巴细胞炎症过程中,微血管内皮被激活并产生前列腺素,抑制淋巴细胞转化,出现巨噬细胞和淋巴细胞浸润,导致淋巴细胞在CSF中占主导地位[16]。同时血脑屏障被破坏,外周血蛋白成分进入CSF及鞘内合成免疫球蛋白,引起CSF总蛋白呈现轻度升高。

针对CIS急性期患者的治疗,专家共识建议应用大剂量、短疗程糖皮质激素,原则上总疗程不超过3～4周[17]。越来越多的研究结果显示疾病修正疗法可延缓CIS向MS的转归,或可降低复发率[18]。但亦有研究指出在CIS发病后和转化为MS之前使用疾病修正疗法并无显著的保护作用[19]。本研究纳入的CIS患者急性期激素治疗疗程均小于1个月,绝大多数的患者症状达到完全缓解的程度,但3年的随访中复发率为58.11%,稍高既往报道的平均水平,进一步为CIS患者缓解期仍需要免疫调节治疗提供证据。此外,Th17细胞相关因子变化,包括IL-6水平升高、IL-10水平降低等是NMOSD等多种自身免疫疾病的共有现象,其特异性较低[20]。后续仍需对CIS转归MS预测指标的特异性进行深入研究。

综上所述,CSF IL-17A和IL-23水平增高可能是预测CIS转归为MS的潜在生物标志物。在临床诊疗中,监测CIS患者CSFIL-17A和IL-23水平有可能预防CIS转归为MS,这可能为CIS患者制定新的治疗方案提供科学依据。