饥饿胁迫对鳙肌肉品质及肠道健康的影响

2023-06-06万金娟张国清沈美芳林海张美琴邵俊杰

水产养殖 2023年5期

万金娟，张国清，沈美芳*，林海，张美琴，邵俊杰

（1.江苏省淡水水产研究所，江苏南京 210017；2. 江苏经贸职业技术学院，江苏南京 211168）

在自然界和人工养殖条件下，水产动物时常因季节变化、环境改变、投饲不均、食物短缺等因素影响，而受到饥饿胁迫。研究表明，饥饿胁迫，对水产动物的生长、形态学指标、体组成、能量利用和肠道健康等方面，会产生显著影响[1-4]。秋季是鱼类生长的高峰期，越冬期也将大量消耗鱼类能量，因此秋季应保证鱼类摄取足够多的能量，以满足其越冬需求。由于部分养殖户饵料投喂不足，导致鱼体质变差，甚至发生病害，这也是近年来淡水鱼“越冬综合征”暴发的主要原因之一[5]。

国内外研究一直关注在饥饿状态下水产动物生理生化的变化，覃川杰等[6]发现，饥饿胁迫，可能会促进瓦氏黄颡鱼（Pelteobagrus vachelli）肝脏脂肪分解，降低脂肪的生物合成；Caruso 等[7]在欧洲舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）和黑斑鲷（Pagellus bogaraveo）的饥饿试验中发现，长期饥饿，会降低鱼体的免疫力；赖婷等[8]报道了克氏原螯虾（Procambarus clarkii）在面临饥饿胁迫时，改变其能量物质利用途径，并产生强烈的肠道应激反应；冀东[9]也指出，饥饿20 d，显著降低草鱼（Ctenopharyngodon idella）的质量增加率、肌肉粗蛋白质和粗脂肪的含量。近年来，饥饿对水产动物消化系统影响的研究，开始由组织结构和消化酶向肠道微生物群落结构[10-14]转变。肠道微生物存在于水产动物胃肠道黏膜和内容物中，在肠道健康中发挥着重要作用，影响着宿主的生长发育、对营养物质的消化吸收和免疫功能等[15-17]。因此，维持肠道菌群的平衡和稳定，是保证鱼类机体健康的关键。影响肠道菌群结构的因素有很多，主要包括物种、宿主性别、养殖环境、生长阶段和饵料等[18-19]，其中饵料是影响肠道微生物群落的重要因素。

鳙（Aristichthys nobilis）属硬骨鱼纲（Osteichthyes），鲤形目（Cypriniformes），鲤科（Cyprinidae），鳙属（Aristichthys），是我国主要淡水经济鱼类之一。近年来，其年产量维持约310 万t[20]，其产量在淡水鱼中，仅次于青鱼（Mylopharyngodonpiceus）、草鱼（Ctenopharyngodonidellus）和鲢（Hypophthalmichthys molitrix）。鳙具有较高的营养价值，且肉质鲜嫩，价格便宜，深受消费者欢迎[21]。胡伟华等[22]研究了净化时间对微流水系统中鳙品质的影响。目前，关于饥饿胁迫对传统池塘养殖环境下鳙的影响的研究未见报道。现以鳙为研究对象，开展了越冬前饥饿胁迫对鳙品质和肠道微生物群落结构的影响试验，为进一步探索鳙越冬前的养殖管理，提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

鳙幼鱼（平均规格约为500 g/尾）来自江苏省淡水水产研究所浦口基地。挑选同一批次、规格整齐、健壮的鳙，于2021 年3 月14 日分别放入基地的2口池塘（均为2 668 m2）中，每667 m2放养100 尾。5 月5 日，开始投喂市售淡水鱼商品料（粗蛋白28%，粗脂肪4%），每日07：00 和18：00 分别投喂1 次，投喂量为鱼体质量的4%~5%。9 月1 日开始饥饿胁迫试验，设置2 个试验组，其中一组为正常投喂组（对照组）；另一组不再投饵，为饥饿组。当水温自然下降到鳙停止摄食（水温约15 ℃）时，试验结束（11 月18 日），采集样品。试验期间，2 组鱼均按照实际养殖管理模式，水温15~29 ℃，pH 值6.7~7.9，ρ（溶解氧）4.1~5.9 mg/L，ρ（氨氮）＜0.48 mg/L。

1.2 样品采集与分析

在2 口池塘分别采集6 尾鱼，平均体质量为（1.78±0.12）kg。在鱼鲜活的状态下，用采样箱快速运回实验室（路程为1 h）。重击鱼头部致死，采其背部和腹部肌肉（每尾鱼沿测线下方约采取50 g 腹部肌肉）。用解剖刀将背部肌肉制成1 cm×1 cm×1 cm 的小方块，用于质构特性测定；用研磨仪将腹部肌肉制成鱼糜，用于肌肉常规营养成分及氨基酸含量的测定。最后用乙醇擦拭鱼体消毒，在无菌操作条件下，解剖取出肠道内容物，并迅速置于液氮中冷冻，随后转移至-80 ℃冰箱中保存，用于检测肠道菌群。

1.2.1 肌肉质构特性测定

参照文献[23]的质构剖面分析（TPA）方法，使用TA-XTplus 质构仪（英国Stable Micro System 公司），检测硬度、弹性、内聚力、咀嚼性和恢复性等肌肉质构参数。每尾鱼测5 个平行。

1.2.2 肌肉常规营养成分含量测定

分别根据《食品安全国家标准食品中水分的测定》（GB 5009.3—2016）中直接干燥法、《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）中凯氏定氮法、《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》（GB 5009.6—2016）中索氏抽提法和《食品安全国家标准食品中灰分的测定》（GB 5009.4—2016）中550 ℃马弗炉灼烧法，测定肌肉中水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量[24]。每尾鱼取1 个样品。

1.2.3 肌肉氨基酸组成及含量的测定

根据《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》（GB 5009.124—2016），使用LA8080 超高速全自动氨基酸分析仪（日本HITACHI 公司），测定肌肉中氨基酸含量。每尾鱼取1 个样品。

1.2.4 肠道菌群16S rRNA 测序分析

每尾鱼各取1 个肠道内容物样品，共计12 个样品，送至上海凌恩生物科技有限公司，进行DNA提取和测序分析。DNA 提取后，用细菌16S rRNA的V3-V4 区特异性引物进行扩增，引物序列为F:515F5’-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’,R:907R5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’。利用Illumina 公司的NovaSeq PE250 平台，对菌群DNA 片段双端（Paired-End）测序；对数据进行过滤，获得Clean data；使用FLASH 软件（version 1.2.7）进行拼接；使用UPARSE 软件（version 7.1），根据97%的相似度对序列进行OTU 聚类；采用RDP classifier（version 2.2），对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 16S rRNA 数据库（v138），基于注释结果对样品分析等[25-26]。

1.3 数据统计与分析

使用在线工具“Draw Venn Diagram”（http://bioinformatics.psb.ugent.be/web tools/Venn），绘制维恩图，分析2 个试验组中重叠和独特的OTU。肌肉各项指标数据经Excel 2019 软件处理后，Alpha 多样性[包括Shannon 指数、Simpson 指数（1-D）、coverage、Chao1 指数、Ace 指数等]通过Mothur v.1.21.1 软件计算后，采用SPSS 23.0 软件的独立样本t检验（Independent samplest-test），进行差异显著性分析，P<0.05 表示差异显著。结果均以（平均值±标准误）表示。使用UniFrac 进行Beta 多样性分析。

2 结果与分析

2.1 饥饿胁迫对鳙肌肉质构特性的影响

饥饿胁迫下鳙肌肉质构特性见表1。由表1可见，饥饿组鳙肌肉的硬度、黏性、咀嚼性以及恢复性显著高于正常投喂组（P<0.05）；2 组间鱼肉的弹性差异不显著（P>0.05）。

表1 饥饿胁迫下鳙肌肉质构特性①

2.2 饥饿胁迫对鳙肌肉常规营养成分的影响

饥饿胁迫下鳙肌肉常规营养成分含量见表2。由表2 可见，2 组间鳙肌肉中水分、粗蛋白、粗脂肪含量均呈显著性差异。其中，与正常投喂组相比，饥饿组的水分含量显著提高；粗蛋白和粗脂肪含量显著降低（P<0.05）。2 组间灰分含量的差异不显著（P>0.05）。

表2 饥饿胁迫下鳙肌肉常规营养成分含量（湿质量基础）①%

2.3 饥饿胁迫对鳙肌肉氨基酸组成的影响

饥饿胁迫下鳙肌肉氨基酸组成见表3。由表3可见，饥饿组鳙肌肉中必需氨基酸、非必需氨基酸、鲜味氨基酸以及总氨基酸含量均显著低于正常投喂组（P<0.05）；2 组间除蛋氨酸含量差异不显著（P>0.05），其他氨基酸均为饥饿组含量显著低于正常投喂组（P<0.05）。在氨基酸组成上，2 组间必需氨基酸、非必需氨基酸以及鲜味氨基酸总量占氨基酸总量的百分比差异不显著（P>0.05），正常投喂组的必需氨基酸总量占非必需氨基酸总量的百分比（75.90%）显著高于饥饿组（65.41%）（P<0.05）。

表3 饥饿胁迫下鳙肌肉氨基酸组成（湿质量基础）① %

2.4 饥饿胁迫对鳙肠道微生物群落结构的影响

饥饿胁迫下鳙肠道微生物Beta 多样性见图1。由图1 可见，PCoA 分析显示，正常投喂组和饥饿组鱼的肠道菌群组成存在明显的差异。

图1 饥饿胁迫下鳙肠道微生物Beta 多样性（PCoA 分析）

饥饿胁迫下鳙肠道微生物Alpha 多样性见表4。由表4 可见，与正常投喂组鳙肠道微生物多样性相比，饥饿组鱼肠道群落Shannon 指数显著降低、Simpson 指数显著提高，代表丰富度水平的Chao 1 指数在饥饿组显著降低（P<0.05）；2 组间的Ace 指数差异不显著（P>0.05）。

表4 饥饿胁迫下鳙肠道微生物Alpha 多样性①

OTU venn 图见图2。由图2 可见，正常投喂组和饥饿组，鳙肠道中独有的OTU 分别为802 和215个，865 个OTU 为2 组共同拥有。

图2 OTU venn 图

在门水平上（图3），正常投喂组鳙肠道中相对丰度较高的优势门有变形菌门（Proteobacteria）（34.38%）、放线菌门（Actinobacteriota）（23.02%）、蓝细菌门（Cyanobacteria）（12.64%）和拟杆菌门（Bacteroidota）（6.95%）；饥饿组鳙肠道中相对丰度较高的优势门有梭杆菌门（Fusobacteriota）（44.16%）、厚壁菌门（Firmicutes）（16.33%）、蓝细菌门（Cyanobacteria）（12.20%）、变形菌门（Proteobacteria）（7.84%）和放线菌门（Actinobacteriota）（8.62%）。与投喂组相比，饥饿组肠道变形菌门和放线菌门的丰度显著降低，梭杆菌门和厚壁菌门的丰度显著增加（P<0.05）。

图3 各类群在门水平上的相对丰度

各类群在属水平上的相对丰度见图4。由图4可见，正常投喂组鳙肠道中，相对丰度较高（＞5%）的优势属有Chloroplast_norank（9.63%）、PeM15_norank（7.70%）、分枝杆菌属（Mycobacterium）（6.39%）和罗河杆菌属（Rhodanobacter）（6.04%）；饥饿组鳙肠道中，相对丰度较高的优势属有鲸杆菌属（Cetobacterium）（44.14%）、迪尔玛菌属（Dielma）（8.70%）、蓝细菌属（Cyanobium PCC-6307）（6.12%）和PeM15_norank（5.80%）。与投喂组相比，饥饿组肠道鲸杆菌属、迪尔玛菌属、蓝细菌属的丰度显著增加（P<0.05）。

图4 各类群在属水平上的相对丰度

3 讨论

鱼类在生长过程中，经常面临饥饿自然生理胁迫[27]。饥饿在改变鱼体外观形态和内部器官的同时[2]，也会影响肌肉品质。其中，以硬度、弹性、黏性、咀嚼性、恢复性等为代表的质构参数，可以直观反映肌肉的品质[28]。有研究[22，29]指出，营养物质的代谢会影响质构参数，其中肌肉硬度与脂肪代谢程度呈反比，即脂肪含量越低，肌肉硬度越大；也有研究表明，鱼肉咀嚼性增加，会伴随着肌肉中水分和脂肪的升高[30]。冀东[9]报道了草鱼饥饿30 d后，其肌肉硬度、咀嚼性显著提高。本试验也同样发现，饥饿组鳙肌肉的硬度、黏性、咀嚼性和恢复性显著提高，这与该组肌肉水分含量升高、脂肪含量下降有一定的关系。同时也有研究指出[22]，鱼类在饥饿过程中，因寻找食物而增强运动活性，从而消耗脂肪，其肌肉硬度更接近于野生同类。

在饥饿状态下，鱼类不能直接从外界获得必要的营养物质和能量，只能被迫动用自身贮存的能量，来维持机体能量代谢平衡和生命活动[31]，糖类、脂肪和蛋白质作为机体的主要贮能物质，在这个过程中，会被不同程度地分解利用[32-33]。在本试验中，长期饥饿，导致鳙肌肉中粗蛋白、粗脂肪含量显著降低，肌肉水分显著升高。这与朱站英等[34]和武文一等[35]的研究结果一致。（Miichthys miiuy）幼鱼经不同程度的饥饿（0，3，6，9，12 和15 d）后，氨基酸含量显著降低[36]；苏蕙等[37]发现饥饿处理后，卵形鲳（Trachinotus ovatus）幼鱼的氨基酸代谢途径增强。本试验中，鳙在长期饥饿胁迫后，肌肉氨基酸含量显著降低。此外，饥饿组鱼肌肉中鲜味氨基酸含量相对较低，可能是因为其摄入营养相较于投喂组更单一[38]。但是由于受品种、生长发育阶段、饥饿时间以及饥饿前鱼类能量储备的影响，鱼类的能量代谢情况有所差异，导致对自身能量的利用也并不一致[22，39]；因此也有报道指出，饥饿对鱼类体成分无显著影响[6]。

鱼类肠道微生物，在宿主营养代谢和免疫调控进程中发挥着重要作用[40-41]。肠道菌群的失衡，会导致机体内环境紊乱，从而诱发疾病甚至死亡[42]。宿主营养状态的改变也能反作用于肠道菌群[43-44]。文献[45]指出，在饥饿状态下，机体也可以通过调节肠道微生物种群的数量和组成结构来适应自身能量的需求。本试验中，鳙在遭受饥饿胁迫，其肠道微生物群落的多样性和丰度显著减低，表明饥饿处理，能显著影响鳙肠道菌群的组成。图2 结果也佐证了上述观点。究其原因，可能是由于机体和肠道微生物，在机体饥饿状态下同时面对能源危机，前者会倾向于缩小肠道“尺寸”[46-48]，从而导致后者相应的发生菌群多样性和相对丰度的改变。Semova 等[49]在斑马鱼（Danio rerio）饥饿试验中，同样发现肠道微生物多样性呈现下降趋势。此外，本试验中，在正常投喂情况下，变形菌门、放线菌门、蓝细菌门和拟杆菌门为优势菌，饥饿胁迫可显著影响其微生物结构组成，其中差异最显著的变形菌门在饥饿后下降，梭杆菌门在饥饿后增加。在菌群功能上，变形菌门作为许多水产动物肠道中的常驻菌，是相对丰度最高的细菌门；变形菌门丰度的改变，通常会导致肠道微生物群落的失衡，因此其在肠道内的比例，能够反映肠道微生物群落结构的稳定性，是肠道菌群失调的微生物标志[50]。在人类溃疡性结肠炎研究[51]中发现，梭杆菌门在肠炎患者肠道菌群中的丰度，相比于健康人群显著增高，与本试验结果一致。表明长期饥饿，会提高鳙肠道梭杆菌门的丰度，导致肠炎的发生，但其中具体的影响机制有待进一步研究。在属水平方面，饥饿组肠道鲸杆菌属、迪尔玛菌属、蓝细菌属的丰度，相较于正常投喂组显著增加。其中鲸杆菌，可通过激活鱼的副交感神经来改善葡萄糖稳态，并使胰岛素表达增加[52]；此外，在未投喂饵料的情况下，浮游生物是鳙的主要食物；对浮游植物而言，鳙以滤食蓝藻和绿藻为主[53]，因此饥饿组鳙肠道蓝细菌属水平，显著高于正常投喂组。