基于微卫星标记的中华绒螯蟹遗传多样性分析

2023-06-06田间马行空曾健成王志红葛家春

水产养殖 2023年5期

田间，马行空，曾健成，王志红，葛家春*

（1.江苏省淡水水产研究所，江苏南京 210017；2.江苏省科技资源统筹服务平台长江系中华绒螯蟹种质资源库，江苏南京 210017；3.南京师范大学海洋科学与工程学院，江苏南京 210023）

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis），又名河蟹、大闸蟹，隶属于甲壳纲（Malacostraca），十足目（Decapoda），方蟹科（Grapsidae），绒螯蟹属（Eriocheir）[1]，广泛分布于我国长江中下游地区，是我国重要的经济型蟹类之一，其营养丰富，肉质鲜美，市场认可度极高[2]。河蟹地理分布也十分广泛，在我国形成了“长江蟹”“辽河蟹”“瓯江蟹”三大蟹系，其中长江蟹以产量高、味道鲜美而闻名[3]。

20 世纪80 年代后期，由于过度捕捞、水利设施建设、水体污染和栖息地被破坏等因素，天然蟹苗资源急剧衰退[4]。目前，随着河蟹养殖产业规模的壮大，天然苗种已无法满足河蟹生产需求。人工育苗的开展，解决了大部分养殖企业、养殖户的苗种需求，但引进多水系亲本、小规格亲本滥用等，出现了幼蟹培育成活率低、规格参差不齐、性早熟等现象[5-6]。河蟹种质问题已然成为制约河蟹产业发展的主要因素之一。在当前河蟹的群体选育过程中，由于多年连续选育且不引进外来亲本，可能导致有害等位基因和无用性状积累到河蟹种群中，有导致河蟹适应性和遗传多样性降低的风险[7]。因此，开展河蟹群体的遗传多样性研究，对遗传育种极为重要。

微卫星，又名简单串联重复序列（SSR），或短串联重复（STR），是以1~6 bp 的重复单位组成的串联重复序列，具有数量多、多态性丰富和易于检测等特点[8]。微卫星多年来被广泛用作遗传差异的标记，其中包括基因图谱、种群遗传学和法医学[9]。目前，关于微卫星在河蟹遗传多样性方面的研究已有报道。熊良伟等[10]利用37 对微卫星标记，构建了河蟹家系遗传图谱。李晓晖等[11]利用10 对微卫星标记，对长江水系3 个选育群体和野生群体进行了遗传分析。许志强等[12]用6 对微卫星标记对4个水系河蟹天然群体进行了遗传多样性分析。

现于2021 年利用6 个多态性丰富的微卫星分子标记，比较分析了单年系F5 代选育群体、“长江2 号”和长江野生群体的遗传多样性以及群体间的遗传分化，以期为河蟹的良种选育和种质资源保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于江苏省淡水水产研究所扬中基地和长江通江河道（非禁捕区域），采集3 个河蟹群体同属奇数年群体，共90 个河蟹个体（表1），运输至实验室后，于-20 ℃保存。

表1 3 个群体河蟹样本采集信息

1.2 DNA 提取与检测

剪取河蟹附肢肌肉50~80 mg，于1.5 mL 离心管中，加入裂解液和蛋白酶K 混匀，于55 ℃水浴锅消化1.5 h，直至溶液澄清透明。再向裂解液中加入RNase A，于37 ℃水浴锅消化1 h。按照传统酚、三氯甲烷和异戊醇法提取组织DNA。1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 纯度和完整性，超微量紫外分光光度计（Thermo Scientific，美国）检测其质量浓度，稀释至50 μg/L，于-20 ℃保存备用。

1.3 PCR 反应体系、反应程序及扩增产物的检测

用6 对已报道的具有多态性的微卫星引物，分析3 个河蟹群体的遗传多样性（表2）。PCR 反应体系总体积：2×Taq Plus Master Mix II（Vazyme，南京）12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 扩增反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火45 s；72 ℃延伸45 s，34 个循环；72 ℃延伸5 min。PCR 反应结束后，产物于4 ℃保存。

表2 河蟹6 个微卫星位点的引物信息

用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色，检验PCR 扩增产物多态性。银染后，凝胶由Tanon 凝胶成像仪扫描成像。

1.4 数据统计与分析

等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、Shannon指数（I）、Nei氏遗传距离和遗传相似度，采用Popgen 1.32 软件计算；多态信息含量（PIC）采用Cervus 3.0 软件计算。群体间遗传分化指数（Fst）、群体分子方差分析（AMOVA），采用Arlequin 3.5 软件计算。系统树根据Nei氏遗传距离通过MEGA 5 软件，采用非加权配对算数平均法（UPGMA）构建。

2 结果与分析

2.1 微卫星位点多态性

6 个微卫星位点的遗传多样性参数见表3。6 个微卫星位点共检测出53 个Na，值为7~11，每个位点平均有17 个。Ne为4.539 4~9.529 4，平均值为7.100 3。I为1.668 3~2.312 3，平均值为2.023 3。Ho为0.638 9~0.861 1，平均值为0.745 4。He为0.790 7~0.907 7，平均值为0.862 2。PIC为0.779 7~0.895 1，平均值为0.850 2。根据Botstein等[14]的标准，PIC≥0.5 为高度多态性。本研究中的6 个位点均为高度多态性位点，说明这些位点均可提供丰富的遗传信息，能够有效地进行河蟹群体遗传多样性评估。F检验数据显示，在6 个位点中，有1 个位点的近交系数（Fis）值为负值，其余5 个位点为正值，表明近交程度较高。6 个位点遗传分化指数（Fst）的平均值为0.066 1。根据Wright 建议，4 个位点遗传分化程度中等（0.05

表3 6 个微卫星位点的遗传多样性参数①

2.2 3 个河蟹群体的遗传多样性

3 个河蟹群体的遗传多样性见表4。由表4可见，长江野生群体的Na（7.666 7）、Ne（5.718 3）、I（1.909 9）、Ho（0.780 0）均为最高。所有群体的PIC均＞0.5，表明群体的遗传多态性较高，具有较大的选择潜力。

表4 3 个河蟹群体的遗传多样性

2.3 群体遗传结构

群体间的遗传分化指数见表5。由表5 可见，3个河蟹群体间Fst为0.052 69~0.084 82，其中单年系F5 代选育群体与长江野生群体体间遗传分化系数最大（Fst=0.084 82），各群体间均属于中等程度的遗传分化（0.05

表5 群体间的遗传分化指数（Fst）

群体的分子方差分析见表6。由表6 可见，群体间变异占总变异的5.34%，且达到显著水平（P<0.05），94.66%的遗传变异来自种群内个体间，这表明个体间的遗传变异远大于群体间的遗传变异，遗传变异主要存在于个体间。

表6 3 个河蟹群体的分子方差分析①

3 个河蟹群体的遗传相似度和遗传距离见表7（以“****”为界，右上角为遗传相似度，左下角为遗传距离）。由表7 可见，3 个群体的Nei氏遗传距离为0.402 8~0.469 3。单年系F5 代选育群体与长江野生群体间的Nei氏遗传距离最远（0.469 3），遗传相似度最低（0.568 5）。单年系F5 代选育群体与“长江2 号”群体Nei氏遗传距离最近（0.402 8），遗传相似度最高（0.688 5）。

表7 3 个河蟹群体的遗传相似度和遗传距离

基于Nei’s遗传距离构建的3 个河蟹群体的UPGMA 系统进化树见图1。由图1 可见，单年系F5代选育群体首先与“长江2 号”群体聚为一类，再与长江野生群体聚为一类。

图1 基于Nei’s 遗传距离构建的3 个河蟹群体的UPGMA 系统进化树

3 讨论

3.1 群体遗传多样性

基因杂合度是反映群体遗传变异的一个最适参数，微卫星位点平均杂合度反映了遗传结构变异程度高低，杂合度越大则变异越大，群体的稳定性越高，选择潜力越大[15]。本研究中，3 个河蟹群体的He介于0.817 6~0.847 8。许志强等[12]于2009 年收集了4 个河蟹群体，平均He为0.714 9 ~0.758 5；李晶晶等[16]于2012—2013 年收集了4 个河蟹群体，平均He为0.720~0.745，其值均低于本研究。Botstein等[14]研究表明，当PIC≥0.5 时为高度多态性，当0.25≤PIC＜0.5 时为中度多态性。本研究中，3 个河蟹群体PIC值为0.784 1~0.812 5，均为高度多态性群体，表明其遗传多样性均处于较高水平，种质资源良好，有一定的种群稳定性，其中单年系F5 代选育群体和“长江2 号”2 个选育群体仍具有较大的选择潜力。

Na和Ne的值越接近，等位基因在群体中分布的越均匀[17]。本研究中，3 个群体的平均Ne小于Na，不均匀程度大小依次为单年系F5 代选育群体、野生群体、“长江2 号”群体。主要原因是等位基因在群体中分布不均匀，导致等位基因的频率不够平均[18]。本研究中，长江野生群体等位基因数和有效等位基因数，均高于单年系F5 代选育群体和“长江2 号”群体，其原因可能是近年来的增殖放流，导致长江野生河蟹与其他水系河蟹基因交流增加，在一定程度上提高了长江野生河蟹的遗传多样性。

3.2 群体遗传分化与遗传距离

Fst是用来衡量群体间遗传分化程度的重要参数。Balloux 等[19]认为，Fst值为0~0.05，表明群体间的遗传差异很小；Fst值为0.05~0.15，表明群体间发生了中等水平的遗传分化；为0.15~0.25 时，表明群体间存在较大的遗传差异；当Fst>0.25 时，表明群体间高度遗传分化。本研究中，3 个群体两两比较，遗传分化Fst值为0.052 69~0.084 80，表明群体间均有不同程度的遗传分化。单年系F5 代选育群体与“长江2 号”群体Fst值较小（0.052 69），此结果与实际生产情况相符，单年系F5 代选育群体部分亲本来源于“长江2 号”群体。Karnosky 等[20]认为，异交物种来源于种群之间的遗传变异应>90%，而本研究的分子方差分析（AMOVA）显示，94.66%的遗传变异来自种群内个体间，而来源于种群间的变异只有5.34%。这与刘青等[21]研究结果相似（群体间0.10%，部分变异来源于群体内个体间14.02%，绝大部分变异，来自个体内部85.88%）。表明3 个河蟹群体遗传变异多发生在群体内个体之间，群体内个体差较大，存在杂合子缺失的现象[22]。基于遗传距离的聚类分析，本研究中UPMGA 聚类树结果与各群体间的遗传距离结果一致，单年系F5 代选育群体与“长江2 号”群体遗传距离较小，与长江野生群体的遗传距离较大；聚类分析结果也表明，单年系F5 代选育群体先与“长江2 号”群体聚为一支，再与长江野生群体聚为一支。