烟草根黑腐病化学防治药剂及复配增效配方的筛选

黄婉媛, 李彩斌, 彭 宇, 李章海, 黄衍章, 丁 婷*

(1.安徽农业大学 植物保护学院,植物病虫害生物学与绿色防控安徽普通高校重点实验室,作物有害生物综合治理安徽省重点实验室,安徽 合肥 230061;2.贵州省烟草公司毕节市公司,贵州 毕节 551700;3.中国科学技术大学 烟草与健康研究中心,安徽 合肥 230026)

烟草根黑腐病的病原菌为根串珠霉菌(Thielaviopsisbasicola),近些年该病在贵州毕节的各烟区频繁发生,危害逐年加重,成为当地烟区中一类重要的土传病害[1]。该病的发生贯穿烟草的苗期到成株期,主要侵染的部位为根系,导致根系腐烂、植株死亡。烟草根黑腐病近些年的不同程度流行,给当地进一步促进烟叶的优质发展带来了很大的制约作用,当前防治该病的主要手段之一为化学药剂[1]。针对烟草根黑腐病菌的防治,研究人员在商品化单剂方面开展了一系列的筛选、研究工作。王文凤[2]经过研究发现,在烟草根黑腐病菌分生孢子萌发过程中,抑制效果最明显的药剂为多菌灵、吡唑嘧菌;田间防治效果方面,效果较明显的药剂为甲基托布津、多菌灵。赵永强等[3]经过研究,认为在烟草根黑腐病菌的菌丝生长阶段,抑制效果较强的药剂有甲基托布津、多菌灵、大生M-45、杀毒矾;而多菌灵与大生M-45交替施用可使用药的效果最为明显[4]。当前市场上用于烟草根黑腐病菌防治的主要化学药剂包括甲基托布津、甲霜灵锰锌、福美双、多菌灵等[5-6]。

近年来,有研究表明,某种杀菌剂的长期单一应用可以降低防效,通过选择作用机理不同的杀菌剂进行复配,不仅可使防效好于单一药剂,还可以减少药剂用量、减少对环境及烟草植株等作物的污染[7]。因此,该研究拟根据杀菌剂作用机理的不同,参考王文凤[2]、赵永强等[3]的商品药剂筛选试验结果,选取7种防治烟草根黑腐病菌的常用商品化制剂开展烟草根黑腐病菌的室内毒力测定,并在此基础上选取抑制作用较好的单剂,将不同作用机制的单剂按照比例进行复配,检验其是否具有增效作用,以期在降低药剂浓度的前提下,增强烟草根黑腐病的防治效果,在一定程度上降低化学药剂对作物及环境的影响,为毕节烟区烟叶的绿色生产提供一定技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

烟草根黑腐病菌根串珠霉(Thielaviopsisbasicola),由本实验室自贵州毕节烟区烟草根黑腐病发病田块采集,分离并保存。

1.2 供试杀菌剂

苯丙咪唑类杀菌剂：甲基硫菌灵(甲基托布津)、多菌灵;有机硫类杀菌剂：福美双、代森锰锌;咪唑类杀菌剂：咪鲜胺;复配杀菌剂：甲霜·锰锌、恶霜灵·锰锌。供试药剂及相关信息见表1。

表1 供试药剂、生产厂家及浓度设置Table 1 Test reagent, manufacturer and concentration setting

1.3 试验方法

1.3.1 单剂对烟草根黑腐病菌菌丝生长的抑制作用测定 在PDA培养基上接种烟草根黑腐病菌,置于恒温培养箱(28 ℃)中培养7 d,备用。之后采用菌丝生长速率法对7种药剂抑制病原菌生长情况进行研究。各供试药剂先进行高浓度母液的配制(溶剂为无菌水),之后吸取一定量的母液分别与融化且冷却到约45 ℃的15 mL PDA固体培养基进行混合,即可成为含有药剂、浓度不同的PDA固体培养基,空白对照为加入等量无菌水的PDA培养基(CK)。取培养好的烟草根黑腐病菌PDA平板,在菌落的边缘位置用直径6 mm的打孔器打孔,即可获得6 mm的菌饼。之后在含有药剂的PDA培养基中央接种1个6 mm的菌种。每种药剂处理均按照表1设置5个不同质量浓度梯度(表1),每个浓度均设5次重复,于27 ℃的恒温生化培养箱内进行黑暗培养,当对照的菌落直径达6 cm时,即可进行菌落直径的测定(十字交叉法),各处理的5次重复取平均值,进行菌丝生长抑制率的计算。在此基础上,利用统计软件将菌丝生长抑制率换算为生物统计机率值(y),药剂浓度换算成对数(x),根据浓度对数与机率值回归法,得到线性回归方程,由所得的回归方程计算供试药剂处理下烟草根黑腐病菌的相关系数和 EC50及EC90。菌丝生长抑制率的计算公式为：菌丝生长抑制率=[(对照组病原菌菌落直径-处理组病原菌菌落直径)/对照组病原菌菌落直径]×100%。

1.3.2 复配组合的配方筛选 根据上述7种杀菌剂的毒力测定试验结果,参考不同单剂的作用机理[8-9],在课题组前期配比预试验(80% 甲基硫菌灵可湿性粉剂和45%咪鲜胺水乳剂2种杀菌剂中的有效成分按照体积比9∶1、7∶3、5∶5、4∶6、2∶8配制,观察烟草根黑腐病菌在含上述不同复配制剂的平板中的生长情况)结果基础上,该研究又将80% 甲基硫菌灵可湿性粉剂和45% 咪鲜胺水乳剂2种杀菌剂中的有效成分按照体积比2∶1、1∶1、1∶2的比例复配,与融化且冷却到约45 °C固体PDA培养基混合,制成0.5、1、2、4、6和8 mg/L的含药PDA固体培养基,以添加等量无菌水的PDA固体培养基为空白对照(CK)。取培养好的烟草根黑腐病菌,用打孔器在菌落边缘打孔,制成直径6 mm的菌饼,将菌饼转接于含毒培养基中央,每浓度5次重复,置于生化培养箱中27 ℃黑暗恒温培养,当空白对照菌落直径长至约6 cm时,用十字交叉法测量菌落直径,对数据进行统计分析。绘制标准曲线,计算不同处理组复配药剂对烟草根黑腐病菌的毒力回归方程、相关系数和 EC50及EC90,并根据Sun等[10]的方法计算出每组复配药剂的共毒系数(CTC),比较不同处理组复配杀菌剂对烟草根黑腐病菌的毒力效果。其中CTC大于100时,表示复配药剂对烟草根黑腐病菌的毒力起到增效作用,小于100时表示拮抗作用[11]。CTC的计算公式为：共毒系数(CTC)=A的EC50×B的EC50/M的EC50×(PA×B的EC50+PB×A的EC50),其中A和B分别表示2种单剂,M表示这2种单剂的混合药剂,PA和PB分别表示A和B在混剂中的比例。

2 结果与分析

2.1 防治烟草根黑腐病的有效杀菌单剂的筛选

利用菌丝生长速率法,研究7种杀菌剂对烟草根黑腐病菌菌丝生长的抑制效果,结果如表2所示。7种药剂对烟草根黑腐病菌菌丝生长的抑制效果明显,其中,咪鲜胺对烟草根黑腐病菌菌丝生长的抑制作用最强,当咪鲜胺质量浓度为0.5～6 mg/L时,其对烟草根黑腐病菌菌丝生长的抑制作用最低为44.00%,最高达到68.00%;甲基硫菌灵效果次之,当甲基硫菌灵质量浓度为2～10 mg/L时,对烟草根黑腐病菌菌丝生长的抑制作用最低为20.00%,最高达到70.40%;与此同时,代森锰锌的抑制效果最差,当其质量浓度为10 mg/L时,对菌丝生长的抑制率仅为32.00%。

表2 7种药剂对烟草根黑腐病病菌菌丝生长的抑制效果Table 2 Inhibitory effects of seven fungicides on mycelial growth of Thielaviopsis basicola

通过标准曲线计算7种杀菌剂对烟草根黑腐病菌的毒力回归方程、EC50和EC90,结果如表3所示。7种杀菌剂毒力回归方程的相关系数均高于0.98,说明杀菌剂浓度与对烟草根黑腐病菌的抑制效呈显著正相关,其中,咪鲜胺的EC50与EC90分别为1.63和10.99 mg/L,相对于其它杀菌剂,数值均最小,表明咪鲜胺对烟草根黑腐病菌菌丝生长的抑制效果最好;而甲基硫菌灵的抑菌效果次之,其EC50与EC90分别为6.79和13.04 mg/L。参考7种杀菌剂对烟草根黑腐病菌的EC50和EC90,可知7种杀菌剂的有效成分对烟草根黑腐病菌的抑制作用由强到弱依次为咪鲜胺>甲基硫菌灵>福美双>恶霜灵·锰锌>多菌灵>甲霜·锰锌>代森锰锌。

表3 7种杀菌剂对烟草根黑腐病菌的毒力分析Table 3 Virulence analysis of seven fungicides against Thielaviopsis basicola

2.2 复配组合的配方筛选

上述7种杀菌剂的毒力测定试验结果表明,咪鲜胺和甲基硫菌灵对烟草根黑腐病菌具有较好的抑制作用,其EC50和EC90值均显著低于其他5种杀菌剂;甲基硫菌灵主要干扰病菌细胞分裂[8],咪鲜胺则是抑制病原菌细胞甾醇脱甲基化[9],二者作用机理存在差异,因此,本试验在此基础上,进一步开展甲基硫菌灵和咪鲜胺的复配试验,以明确二者复配是否存在增效作用。试验中,将80%甲基硫菌灵可湿性粉剂和45%咪鲜胺水乳剂2种杀菌剂中的有效成分按照体积比2∶1、1∶1、1∶2复配,对复配后得到的不同组合开展对烟草根黑腐病菌的抑菌效果研究,结果如表4所示,45% 咪鲜胺水乳剂和80% 甲基硫菌灵可湿性粉剂2种杀菌剂的有效成分分别按照1∶1和1∶2复配时,对烟草根黑腐病菌菌丝生长的抑制作用均较明显。绘制标准曲线,计算不同处理组复配杀菌剂对烟草根黑腐病菌的毒力回归方程、相关系数和EC50及EC90,结果显示,45% 咪鲜胺水乳剂和80%甲基硫菌灵可湿性粉剂2种杀菌剂的有效成分1∶1复配时,对烟草根黑腐病菌的毒力较强,其EC50及EC90分别为0.19和8.39 mg/L(表5)。

表4 复配药剂对烟草根黑腐病病菌菌丝生长的抑制效果Table 4 Inhibitory effects of compounded fungicides on mycelial growth of Thielaviopsis basicola

表5 复配药剂对烟草根黑腐病菌的毒力测定Table 5 Virulence analysis ofcompounded fungicides against Thielaviopsis basicola

进一步计算2种杀菌剂不同复配组合的共毒系数(CTC),比较复配杀菌剂对烟草根黑腐病菌的毒力效果,结果如表5所示,45%咪鲜胺水乳剂和80%甲基硫菌灵可湿性粉剂2种杀菌剂的有效成分按照2∶1、1∶1、1∶2复配,其共毒系数分别为22.81、245.24和50.79。鉴于CTC大于100表明复配药剂对病原菌的毒力起到增效作用,由此可知,当咪鲜胺和甲基硫菌灵1∶1进行混配,对烟草根黑腐病菌的毒力有明显的协同增效作用,而咪鲜胺和甲基硫菌灵按2∶1和1∶2复配时,对烟草根黑腐病菌的毒力则出现拮抗作用。

3 结论与讨论

烟草根黑腐病作为贵州毕节烟区主要的根部病害之一[1],其发生主要受温度、土壤pH等的影响[12-13],因此,结合烟草根黑腐病菌的侵染方式及生理特点,筛选出防治效果较好的低毒、高效杀菌剂及复配药剂,从而为烟草根黑腐病的防治提供有效保障。该研究中,7种杀菌单剂对烟草根黑腐病菌的毒力结果表明,咪鲜胺和甲基硫菌灵对病原菌菌丝生长的抑制效果较好,明显优于其他杀菌剂,而代森锰锌对病原菌生长的抑制效果最差,多菌灵以及杀毒矾抑菌效果居中。试验结果与赵永强等[3-4]的研究报道有部分差异,赵永强等[3]发现甲基托布津、多菌灵、大生M-45、杀毒矾4种药剂对烟草根黑腐病菌菌丝生长有明显抑制作用,并根据上述4种化学药剂作用机理,确定最佳用药方式为多菌灵与大生M-45交替施用[4]。究其原因,可能是我国不同地区来源的烟草根黑腐病菌致病力分化明显,并具有多样性[14],因此,不同烟区来源的烟草根黑腐病菌可能对不同化学杀菌剂的敏感性存在差异。为了验证此猜想,后续试验中,课题组将广泛采集分离贵州不同烟区的烟草根黑腐病菌,对其生理特征、致病力差异以及对化学杀菌剂的敏感程度进行深入研究。

本研究中,45%咪鲜胺水乳剂和80%甲基硫菌灵可湿性粉剂2种杀菌剂的有效成分按1∶1进行混配,对烟草根黑腐病菌的毒力有明显的协同增效作用。究其原因,可能是甲基硫菌灵属于苯并咪唑类内吸式杀菌剂,其可以干扰病菌有丝分裂中纺锤体的形成,从而影响细胞分裂,对多种病害有预防和治疗作用[8];而咪鲜胺作为一种广谱性内吸式杀菌剂,可抑制病原菌细胞甾醇脱甲基化[9],二者作用机理不同,因此,结合2种杀菌剂不同防治作用机制,将二者进行复配,可达到增效、延缓抗药性的作用。

该试验中,课题组通过室内毒力测定研究了不同化学杀菌剂以及复配制剂对烟草根黑腐病菌菌丝生长的抑制作用,而化学药剂对根黑腐病菌孢子是否具有抑制作用尚不清楚,因此,后续试验中将利用该试验获得的复配化学制剂开展对根黑腐病菌孢子萌发的抑制试验,以期初步了解复配制剂对烟草根黑腐病菌的抑菌机制。此外,由于药剂的作用效果在田间受到温度、湿度等环境条件的影响,室内测定结果与田间施用效果可能会有一定的偏差,因此,复配药剂的防控效果还需要通过进一步的盆栽以及田间试验来验证。

综上,室内杀菌剂毒力测定结果表明,咪鲜胺、甲基硫菌灵2种杀菌剂对烟草根黑腐病菌均具有较强的抑制作用;且咪鲜胺和甲基硫菌灵1∶1复配时,对烟草根黑腐病菌的毒力有明显的协同增效作用,EC50为0.19 mg/L。