黄芽白与红菜薹杂种后代的细胞遗传学特征

李汉仁 陈纪鹏

摘 要 将白菜型油菜不同栽培种‘红菜薹和‘黄芽白进行正反交获得杂种一代，再经过多代自交获得高世代杂种。观察杂种后代形态学特征（叶型、株高、分枝数等）、育性特征（花粉育性、自交结实率）和花粉母细胞减数分裂染色体行为特征。结果表明经过多代自交，杂种后代各性状趋于稳定，正反交杂种形态有较大差异，而高世代杂种与杂种一代相比，形态没有明显变化。杂种后代花粉育性和自交结实率都比较高，花粉可育率均达到90%以上，但与双亲相比仍然稍差。杂种后代花粉母细胞减数分裂比较正常，但仍有少数细胞出现异常染色体行为。杂种后代减数分裂终变期染色体联会主要以形成环状和棒状的二价体为主，但也形成四价体等其他染色体构型。杂种后代中平均形成二价体的数目在6.7～8.2，最多全部20条染色体形成10个二价体，其中形成环状二价体和棒状二价体的比例相差不大。除了形成二价体外，部分花粉母细胞还形成少数四价体。与亲本相比，杂种后代染色体联会出现较多的非同源联会，平均每个细胞形成二价体的数目比亲本少，而形成四价体的数目比亲本多。在减数分裂后期Ⅰ，同源染色体分开并移向细胞两极，减数分裂后期Ⅱ，染色单体分开最终形成四分体。在此过程中，绝大多细胞染色体行为正常，但有个别细胞出现后期Ⅰ染色体不均等分离，有些细胞同源染色体分开时形成染色体桥；有些细胞在减数分裂Ⅱ中期和后期出现落后染色体。此杂种后代减数分裂过程较正常，探明杂种后代的减数分裂特征可为白菜型油菜杂交育种提供理论依据。

关键词 黄芽白；红菜薹；杂种；减数分裂

白菜型油菜（Brassica rapa）是十字花科植物中的一个重要种类，三大油菜栽培类型之一，1  a生或2 a生植物，不同类型间大小、形状和颜色差异很大。白菜型油菜起源于中国，种植历史可以追溯到几千年前[1]。在长期的进化和栽培过程中，形成多个农业生产中重要的亚种、变种和栽培种，根据主要经济性状特征可分为根茎类型、叶菜类型及菜籽类型，一般作为蔬菜作物，也有极为重要的产油作物。白菜型油菜具有丰富的种质资源，生育周期相对较短，具有抗寒、耐旱等特点，能在贫瘠土壤中生长，但是抗病虫性比较弱，油菜籽产量低、芥酸含量比较高[2]。‘黄芽白（B.rapa L. ssp.pekinensis） 属于白菜型油菜，种植历史悠久，是当前广泛栽培的一个种类，结球性好，产量高，口感好，深受人们喜爱。植株抗寒性好，自交亲和性较高，生育期短，有早熟的特性。‘红菜薹（B.rapa L. ssp. chinenses var.purpurea Biale）又称紫菜薹，属于芸薹属芸薹种的菜薹变种，以食用菜薹为主，在武汉、长沙和成都最早种植，后来广泛分布于长江中下游地区[3]。

白菜与近缘种杂交亲和性较好，容易获得杂种后代[4]。白菜与甘蓝型油菜种间杂交后代基因组加倍可以在一定程度上恢复杂种育性，提高杂交后代自交结实率[5]。白菜与甘蓝型油菜杂种后代基因表达谱研究不仅揭示了杂种后代基因表达特征和A与C基因组的结构特征，而且揭示出miRNA在杂种细胞中基因组之间的互作过程中所起的作用[6]。對大白菜与芥菜型油菜杂交获得的异源三倍体细胞学观察结果显示其花粉母细胞减数分裂中形成较多的未联会的单价体，此结果表明三倍体经过自交可创建AA+B染色体的异附加系，并可进一步研究A、B基因组间的亲缘关系[7]。利用结球白菜与包心芥菜杂交，借助InDel分子标记辅助选择技术，在回交后中筛选保留白菜基因组较多的后代可用于改良包心芥菜的结球特征[8]。白菜与黑腐病免疫的埃塞俄比亚芥杂交合成三倍体ABC杂种，并经回交筛选出高抗黑腐病材料[9]。白菜型油菜具有优良的抗根肿病基因[10]，通过白菜型油菜与人工合成的甘蓝型油菜雄性不育系杂交，再经过多代自交成功地将白菜型油菜的抗根肿病性状转移到甘蓝型油菜中[11]。

通过白菜型油菜不同亚种和变种间杂交，可以提高白菜的产量和品质。刘志新等[12]通过对13个不结球白菜杂交后代农艺性状、品质和耐热性进行筛选，获得了综合性状好，耐热性强，适宜在中国南方地区种植的白菜品种。朱世银等[13]采用不同结球白菜配制杂交组合并通过多代轮回选择，筛选出抗病性好、结球性强并耐抽薹的适合中国云南省种植的白菜品种。通过杂交和自交，对白菜型油菜植株和根的鲜质量、叶片数、根粗和总产量等农艺性状的改良效果较好。从品质来看，所有选择的群体都表现出根系硬度下降，根纤维减少，从而提高产品质量[14]。通过不同亲本杂交获得白菜型油菜杂种，再经过多代选择获得适合早春种植的晚抽薹白菜新品种[15]。

经过长期的自然进化和人工栽培选择，白菜型油菜形成了多个亚种、变种和栽培种等不同类型，在农业生产中广泛应用，各类型之间具有较大的遗传差异，具有诸多优良性状。通过不同类型的白菜杂交、自交或回交可有效地聚集优良性状培育新型白菜品种。虽然白菜型油菜种间和种内杂交取得很大进展，但研究多集中在杂种早期世代遗传性状的研究上，而对自交和回交高世代杂种的遗传特征研究较少。‘黄芽白与‘红菜薹虽然同属于一个物种，但形态学差异极大，二者作为蔬菜作物的主要经济性状各有优势。比如‘黄芽白叶片肥厚，结球性好，单株产量高；而‘红菜薹具有早熟，菜薹食用价值高等特点。‘红菜薹花器官较小，自花授粉率较低，往往表现出较强的杂种优势。当前对‘红菜薹的研究多采用传统方法进行新品种的选育以及采用雄性不育系利用其杂种优势[16-17]。本试验通过农业生产中广泛种植的黄芽白和红菜薹杂交并经多代自交获得性状稳定、具有较强杂种优势杂种后代。此杂种后代虽然育性较好，结实率较高，但与双亲相比还有差距。进一步观察杂种后代的有性繁殖过程中花粉母细胞减数分裂特征，寻找杂种花粉败育的细胞遗传学证据，为选育白菜型油菜新品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白菜型油菜有多个变种、亚种和栽培种，是中国常见的油料作物和蔬菜作物。将‘红菜薹‘黄芽白等不同栽培种于2014年10月中旬在宜春学院试验田种植，第2年春季油菜盛花期，采用人工去雄和辅助授粉方法制备白菜型油菜杂种后代，以‘红菜薹为母本‘黄芽白为父本的杂交记为正交组合，获得的杂种后代为F1，以‘黄芽白为母本的杂交组合记作反交组合，杂种后代为F′1。待种子成熟后从母本植株上收取种子，鉴定为真杂种后代进行4代连续自交获得高世代性状稳定的杂种后代（F5和F′5）。2019年，将收获的杂种后代种子于10月中旬在田间种植，行距30 cm，株距15 cm。春季初花期选择生长健壮植株取幼嫩花蕾观察花粉母细胞减数分裂现象，盛花期取花药观察花粉育性，成熟期统计结实率（单株角果数和单角果种子数）。

1.2 试验方法

1.2.1 杂种后代表型观察与结实率统计 植株长出10片真叶时观察测量亲本及杂种后代叶型和叶片大小；终花期测量株型、株高等性状。杂种植株在田间开放自然传粉条件下结实，统计单株角果数和单角果种子数，以此反映杂种后代的育性。设置5个重复，相关数据采用单因素方差分析方法（ANOVA）和卡平方（χ2）进行差异显著性分析。

1.2.2 杂种花粉育性观察 在盛花期选择晴好天气取花药观察花粉发育状况。将取回的花药置于载玻片上压破使花粉散出，用醋酸洋红染色，去除残渣。在显微镜（Nikon Eclipse 80i，日本）下观察花粉形态。花粉发育良好，形状大而圆，染色深的花粉为可育花粉。而染色较浅，形状不饱满的花粉为发育不良、不可育花粉。

1.2.3 杂种后代体细胞有丝分裂观察 油菜现蕾期取幼嫩子房置入浓度为0.1%的8-羟基喹啉溶液常温下处理3 h，取出后用卡诺固定液（体积比为无水乙醇∶冰乙酸=3∶1）处理24 h以上，最后更换新的固定液放入-20 ℃冰箱保存备用。观察前取出固定处理好的子房在清水中洗去表面的固定液，放在装有1 mol/L的HCL溶液的小烧杯中，在60 ℃恒温水浴锅中加热6 min水解，用镊子取出花药清水漂洗去除残余HCL，将水解后的子房放在载玻片上捣碎并滴加适量卡宝品红染色，盖上盖玻片并用力挤后放在显微镜下观察，选取处于分裂期染色体形态典型的细胞拍照保存。

1.2.4 杂种后代花粉母细胞减数分裂观察 在油菜初花期取杂种幼嫩花蕾立即放入卡诺固定液（体积比无水乙醇∶冰乙酸=3∶1）处理24 h以上，再换新的固定液放入-20 ℃冰箱保存备用。观察前取大小合适的花蕾在清水中洗去固定液，然后从花蕾中取花药放入1  mol/L的盐酸中60 ℃水浴加热水解2 min，使细胞质降解利于染色体观察。将花药取出放入清水中洗去酸液，再取出花药置于载玻片上，用摄子将花药挤破使花粉散出，去除花药壁残渣，卡宝品红染色。盖片后置于显微镜下观察花粉母细胞减数分裂。选择处于分裂不同时期、染色体形态典型的细胞拍照记录。

2 结果与分析

2.1 杂种后代形态学特征

以‘红菜薹为母本的正交组合经多代自交产生杂种后代F5，与F1相比表型（叶片大小、株高、分枝数、单角果种子数以及单株角果数等）相似，经多代自交没有发生明显变化（P>0.05）（表1）。苗期表现为叶脉和叶柄呈紫红色偏向亲本红菜薹，后代植株叶缘呈波状有叶裂，叶裂数目不等，叶色比较深，部分植株呈现紫茎特征（图1-A，1-B，1-C）。杂种后代（F1与F5）与双亲相比表现出较明显的杂种优势，叶片和植株都比较高大，分枝数增多，但杂种植株花粉育性和单角果种子数仍低于双亲（图1-D），具有显著差异（P<0.05）（表1）。

反交组合后代经多代自交后代表型也没发生明显变化，F′5和F′1叶片大小、株高、分枝数和单角果种子数等指标之间无显著差异（P>0.05）。苗期叶片尖端卵圆，表面光滑，形态偏向黄芽白，无明显的紫茎特征。杂种后代植株营养生长旺盛，株高、叶片大小、分枝数和角果数等方面与亲本相比差异显著（P<0.05），只是花粉育性和单角果种子数不如亲本（图1-E）。

正反交杂种后代相比较，以‘黄芽白为母本的反交后代F′1和F′5茎杆比较粗壮、叶片肥厚，后期分枝多，单株形成较多的角果，而其他表型性状正反交后代相似。

2.2 杂种后代减数分裂终变期染色体联会

正反交杂种后代染色体数目恒定，均与亲本染色体数目相等，体细胞染色体2n=20（图1- F）。大部分花粉母细胞分裂正常，同一花蕾中的花粉发育进程一致，可观察到90%以上的花粉母细胞处于同一时期。在减数分裂Ⅰ细线期到终变期，细胞核内的染色质螺旋化形成丝状聚集在核中央，少量细丝分散在四周（图2-A）。随着染色质进一步螺旋化，染色体形态逐渐显现，可观察到同源染色体联会现象，但细胞中常出现多条染色体相连在一起的情况，难以区分染色体联会构型（图2-B）。直至减数分裂进入终变期，染色体形态进一步凝缩，未联会的染色体分开，可观察到清晰的染色体形态和联会构型。

前期Ⅰ的终变期是观察染色体联会的最佳时期，亲本植株大部分花粉母细胞20条染色体形成二价体，其中二价体的形态有环状和棒状，只有极少数花粉母细胞中出现2个二价体之间发生部分同源联会形成四价体的现象。杂种后代花粉母细胞减数分裂比较正常，减数分裂终变期染色体联会主要以形成环状和棒状的二价体为主，但也形成四价体甚至其他染色体构型。各杂种后代平均形成二价体的数目在6.7～8.2，最多全部20条染色体形成10个二价体，其中形成环状二价体和棒状二价体的比例相差不大（图2-C，2-D）。除了形成二价体外，部分花粉母细胞还形成少数四价体。但四价体的联会并不紧密，只是两个二价体之间出现连接，这表明非同源染色体间存在部分同源关系而发生了部分同源联会（图2-C）。最多观察到一个细胞内形成二个四价体的现象。另外在杂种后代的极少数花粉母细胞的减数分裂中还出现更多染色体联会的其他染色体联会构型。

与亲本相比，杂种后代染色体联会出现较多的非同源联会，平均每个细胞形成二价体的数目比亲本少，而形成四价体的数目比亲本多，甚至形成更多染色体联会的构型。杂种后代经过多代自交后形成的高世代杂种F5和F′5 染色体异常联会的频率比杂种一代低，形成四价体的频率较低（表2）。

2.3 杂种后代减数分裂后期染色体分离

雜种后代的花粉母细胞在减数分裂后期Ⅰ同源染色体分开移向细胞两极，大多数细胞的染色体步调一致，但有少数细胞中出现个别染色体落后或者提前分离的现象（图3-A，3-B）。也有个别细胞中同源染色体分开时仍有部分连接在一起，最终出现后期染色体桥（表3，图3-C）。而在两个亲本减数分裂过程未发现此类异常现象，表明杂种后代的减数分裂过程存在不稳定现象，这可能是导致花粉育性不如亲本的一个因素。高世代杂种与杂种一代相比异常染色体行为减少，可见经过多代自交减数分裂中染色体行为趋于正常。

在减数分裂中期Ⅰ，染色体形态正常，对称排在赤道板两侧然后移向两极，90%以上的细胞在减数分裂后期Ⅰ染色体呈现10∶10的均等分离（图3-D）。但也有少数细胞出现不均等分离，在4个杂种后代中均以较低的频率出现11∶9的分离方式，甚至在有些细胞中出现12∶8的分离比，而在两个亲本中所有细胞都发生的是10∶10的均等分离（表3）。正反交组合的后代经多代自交后染色体分离也表现得更有规律，均等分离的细胞频率比杂种一代有所增加。

杂种后代的花粉母细胞在减数分裂Ⅰ和减数分裂Ⅱ后期，绝大多数花粉母细胞染色体正常分向两极，最终形成四核细胞（图3-E）。在染色体分离过程中均以5%～17%的频率出现个别落后的染色体和提早分离的染色体，而在两个亲本中发生的频率更低。杂种后代花粉母细胞减数分裂后期随着染色体的分开，有些花粉母细胞的同源染色体不能及时解离而形成后期染色体桥，而在亲本中未观察到后期桥出现。杂种后代花粉母细胞经过两次减数分裂后均形成四个子细胞，未出现其他异常分裂现象（图3-F）。

3 结论与讨论

本试验将白菜型油菜‘黄芽白和‘红菜薹杂交成功得到杂种后代，通过对后代形态学初步分析正反交后代植株特性表现相似，杂种后代营养生长旺盛，与亲本相比，多个表型特征都表现出了较强的营养生长优势。杂种后代营养生长旺盛的现象在白菜型油菜杂交中常常发生，大白菜杂种不但在产量性状上表现出优势，还在耐热等方面表现出较好的特征[18]。不同类型的大白菜间杂种与亲本相比叶片增大、单株鲜质量增加，同时发现多个叶绿体形成相关基因上营养生长期上调表达，而且光合作用增强[19]。南京农业大学研究发现不结球白菜杂种  BrLhcb1基因上调表达使叶绿体中产生更多的类囊体基粒，从而增加叶绿体光合作用，使杂种营养生长更旺盛[20]。

花粉母细胞减数分裂终变期同源染色体联会一般形成棒状（I）、环状（O）等构型的二价体，染色体联会构型可反映同源染色体联会的紧密程度，棒状的二价体可认为形成1个交叉，而环状二价体可认为形成2个交叉，交叉的数目多少与染色体联会的紧密程度呈正相关。在野生拟南芥中平均每个花粉母细胞减数分裂终变期可形成9.24个交叉，而且对8个不同生态型的拟南芥研究发现，不同生态型的拟南芥染色体联会时形成交叉的数目大致相等[21]。白菜（AA）花粉母细胞染色体联会时平均形成交叉数目14.1，平均每对同源染色体形成1.41个交叉，而甘蓝（CC）花粉母细胞花粉母细胞染色体联会时平均形成13.2个交叉，平均每对染色体形成1.46个交叉，而在甘蓝型油菜（AACC）中A和C染色体组联会形成交叉数与二倍体时相同[22]。本研究中‘红菜薹和‘黄芽白两个亲本花粉母细胞在减数分裂中染色体联会分别形成14.1和14.6个交叉，而杂种后代所形成的交叉数目平均在9.8～12.1，明显少于亲本。这也说明杂种后代与亲本之间还存在一定的遗传差异，杂种后代染色体联会时不如亲本染色体联会紧密。

杂种后代经过多代自交，花粉母细胞减数分裂会趋于正常，花粉育性得到恢复，杂种结实率也会提高。白菜与甘蓝型油菜杂种后代F1中，多数植株体细胞染色体数目为29，即双亲配子染色体数目之和，花粉母细胞在减数分裂过程中常出现多价体、单价体及落后染色体等异常现象，形成的花粉育性差。经过两代自交，多数杂种植株细胞染色体数目为38，即为甘蓝型油菜亲本染色体数目，而且植株形态越来越趋近于甘蓝型油菜亲本，花粉母细胞减数分裂异常现象越来越少，花粉育性有较大恢复[23]。甘蓝型油菜与芥菜型油菜杂种后代花粉母细胞减数分裂中染色体除了形成二价体外，也形成较多的其他异常染色体构型，而且還有落后等其他异常染色体行为，这些异常分裂导致杂种一代只有约30%的花粉可育，经过一代自交，花粉育性提高到50%以上[24]。经白菜与芥菜型油菜杂交再经多代轮回选择获得携带芥菜型油菜的基因片段的白菜（AA，2n=20），并且选择到具有黄籽和早花特性的白菜型油菜新材料，其花粉母细胞减数分裂过程完全正常，终变期所有细胞形成10个二价体，第一次减数分裂后期所有细胞均等分离，花粉完全可育[25]。通过对花粉母细胞观察发现减数分裂时期出现少数染色体分裂异常现象，这往往会导致产生染色体数目不等的配子，也可能是影响杂种后代育性的因素之一。本实验中获得的白菜型油菜杂种后代经多代自交形成的高世代杂种性状趋于稳定，花粉母细胞减数分裂趋于正常，花粉育性较好，结实率提高。有望通过进一步选择获得新型白菜品种。

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Abstract The first generation of hybrid was obtained by reciprocal cross of different cultivated varieties of  B.rapa L.var. purpurea and B.rapa L. ssp. pekinensis，and then the high generation hybrid was obtained by multiple generations of selfing. The morphology（leaf type，plant height，number of branches，etc），fertility（pollen fertility and self-setting rate） and meiosis of pollen mother cells（PMC） of hybrids were observed. The results showed that the characters of hybrid offspring tended to be stable，and morphology of positive and negative hybrids was different after several self-crosses. However，there was no significant change in morphology between the high generation hybrids and the first generation hybrid. The pollen fertility and self-setting rate of hybrid were higher than these of their parents，and the pollen fertility rate was above 90%，but it was still slightly worse than its parents. The meiosis of hybrid was normal in the most of PMCs，but there were abnormal chromosome behaviors in others. The chromosome synapses of hybrid offspring at the final stage of meiosis mainly formed ring-and rod-shaped bivalents，but also formed other chromosome configurations such as tetravalents . The average of bivalents formed in hybrid progenies ranging from 6.7 to 8.2，even up to 10 bivalents were formed，and the proportion of ring bivalents and rod bivalents was similar. In addition to formation of  bivalents chromosomes，a few tetravalents were also formed in some PMCs. Compared with the parents，there were more non-homologous synapses in the hybrids. On average，the number of bivalents formed in each cell was less than that of the parents，while the number of tetravalents formation was more than that of the parents，even other synapses were formed. At anaphase Ⅰ，the homologous chromosome segregated and moved to the cell poles，and at anaphase Ⅱ，the chromatids separated and formed tetrads. In the process，the chromosome behavior of most cells was normal，but unequal segregation of chromosome was found in some cell at anaphase Ⅰ.Some chromosome bridges formed in some cells when homologous chromosomes separated.  Some lagging chromosomes formed in some cell in the metaphase Ⅱ and anaphase. The meiosis characteristics of hybrid offspring can provide a theoretical basis for hybrid breeding of B.rapa.

Key words B.rapa L.var. purpurea; B.rapa L. ssp. pekinensis; Hybrid; Meiosis