动物布鲁氏菌病不同初筛及确诊方法组合检测差异性比对分析

刘丽娅 席锐 叶锋 马晓菁 谷文喜 陈荣贵 葛小强 马俊杰 易新萍

摘 要 为探讨布鲁氏菌病采用先初筛、后确诊不同方法及试剂组合检测结果的差异性，对实验室保存的133份牛、羊血清，以英国布病参考实验室RBT、SAT、APHA-cELISA方法为标准确定布病阳性血清73份、阴性血清60份。选择4种初筛方法共6种试剂、2种确诊方法共3种试剂，按照先初筛，对结果阳性样品再确诊的检测程序对确定的133份血清样品分别用6种方法（9种试剂）进行检测，结果表明：用18种组合方法检测牛阳性血清样品，符合率100%的有3种，检测结果假阴性率为0～53.33%；用12种组合方法检测羊阳性血清样品，符合率100%的有2种组合方法，检测结果假阴性率为0～50.00%。用所有方法检测牛阴性血清样品，符合率100%的有1种方法（试剂），检测结果假阳性率为0～77.78%；检测羊阴性血清样品，符合率100%的有4种方法（试剂），检测结果假阳性率为0～41.67%。应用不同的初筛、确诊组合方法检测同批样品，结果出现了多样性。建议布病初筛可优先选择iELISA、RBT、FPA，确诊可优先选择cELISA。

关键词 布鲁氏菌病；初筛；确诊；差异性

布鲁氏菌病作为主要的人畜共患病，不仅对人类健康产生较大的威胁，对畜牧业也造成巨大的经济损失[1]。中国作为农牧业大国，布病发病率较高，特别是人畜之间的传染现象较为严重[2]。近年来布病疫情呈持续上升态势，最主要的原因是传染源的持续存在，病畜没有及时被检出，发现的病畜不能被及时处理，加之畜牧业的快速发展，牲畜交易、流通频繁，造成传染源的扩散[3]。国家布鲁氏菌病防治计划要求在全国范围内实施监测净化，快速、准确的诊断方法及检测产品是有效开展布病防控工作的关键环节和必要条件。

目前，布病的诊断主要采用病原学和血清学方法，相对复杂繁琐、耗时长、危险大的病原学细菌分离方法而言，血清学方法因其快速、简便、费用低等优点，是动物布病检疫最常用的诊断方法[4-8]。布病血清学诊断方法种类很多，但目前还没有任何一种方法能兼具高敏感性、高特异性以及操作简便、易行、快速等优点[9]。为了避免造成阳性动物的误检或漏检，布病检测应先选择敏感性高、操作较为简便、价格低廉的方法进行初筛，再用敏感性、特异性均较高的诊断方法予以确诊，以达到最全面、准确的检测效果[10]。已有报道对布病的不同血清学方法或试剂检测结果存有差异进行了研究分析[11-16]。中国国标《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T18646-2018）中规定，可用RBPT和iELISA方法进行动物布鲁氏菌病的初筛，用SAT和cELISA方法进行确诊。目前国内外对布病的诊断方法研究非常多，实际采用的诊断方法也多种多样，但都存在着不同的缺点[17]。本研究应用不同诊断试剂，及不同先初筛后确诊的组合方法，对布病检测结果进行比对分析。选用4种初筛方法共6种试剂、2种确诊方法共3种试剂，对已确定布病的阴、阳性牛、羊血清进行检测，以此了解应用不同初筛、确诊组合方法及不同厂家诊断试剂检测结果的差异性，以期为中国布病防控工作的有效开展提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材  料

1.1.1 样品 新疆畜牧科学院兽医研究所保存的133份样品，其中牛血清81份，羊血清52份。

1.1.2 诊断试剂 布病对照血清：阳性对照血清购自哈药集团生物疫苗有限公司（201401）），阴性对照血清购自哈药集团生物疫苗有限公司（201403）；标准样品检测试剂：英国参考实验室布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原，英国参考实验室布病试管凝集实验抗原（0054），英国参考实验室APHA竞争性ELISA试剂盒（C223-17）；初筛方法（试剂）：ZS-RBT为北京某所布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原（2017810）；HP-FPA為哈尔滨某公司布鲁氏菌病荧光偏振测定法试管型抗体检测试剂盒（921012-1）；SZ-GICA为深圳某公司布鲁氏菌病抗体快速检测卡（2018041212）；LY-GICA为兰州某公司布鲁氏菌抗体检测试剂盒（胶体金法）（20170501）；ZS-iELISA为某所牛布病间接ELISA抗体检测试剂盒（17111506）；ZD-iELISA为浙江某公司牛布鲁氏菌病间接ELISA抗体检测试剂盒（01117）；确诊方法（试剂）：ZS-SAT为某所布病试管凝集实验抗原（20170620）；BW-cELISA为北京某公司cELISA布鲁氏杆菌抗体检测试剂盒（18040308G）；SZ-cELISA为深圳某公司布鲁氏菌病抗体检测试剂盒（2018030902）。所有试剂、检测卡和试剂盒均在有效期内。

1.2 方  法

1.2.1 血清样本检测与结果判定 所有方法均严格按照国标GB/T18646-2018 的规定和试剂盒说明书进行操作及结果判定。

1.2.2 标准阴、阳性血清样品的确定 对113份血清样品进行布病检测，先用英国参考实验室布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原进行RBT初筛，初筛阳性样品再用英国参考实验室布病试管凝集实验抗原、英国参考实验室APHA-cELISA方法进行确诊。后2种确诊方法检测结果都为阳性的判定为阳性。3种方法检测结果都为阴性的判定为阴性。以此结果为标准确定本试验的标准阴、阳性血清样品。

1.2.3 差异性分析 对上述确定的阳性血清样品，先选择一种初筛方法（试剂）进行初筛，对初筛结果为阳性的样品，再选择一种确诊方法（试剂）进行确诊。对上述确定的阴性血清样品，用9种方法（试剂）分别进行检测（表1）。计算假阳性率=b/（b+d），假阴性率=c/（a+c）[18]。

2 结果与分析

2.1 阴、阳性血清样品的确定

对133份牛、羊血清样品进行检测，最终确定标准牛阳性血清45份、阴性36份；标准羊阳性血清28份、阴性24份（表2）。

2.2 布病牛血清检测结果差异性

2.2.1 牛标准阳性血清样品的检测 对45份标准牛布病阳性血清，选择4种初筛方法共6种试剂、2种确诊方法共3种试剂，按照先应用初筛方法全面检测后，结果为阳性的样品再应用确诊方法进行检测，共有18种检测组合。

结果显示，检测出45份阳性血清、假阴性率为0的有3种组合，分别为ZS-RBT、BW-cELISA；ZD-iELISA、BW-cELISA；ZS-iELISA、BW-cELISA。检测出21份阳性血清、假阴性率最高达53.33%的有3种组合，分别为LY-GICA、ZS-SAT；LY-GICA、BW-cELISA；LY-GICA、BW-cELISA。检测阳性血清为44份的有9种组合，检测阳性血清为43份的有1种组合，检测阳性血清为42份的有2种组合，假阴性率为2.22%～6.67%。

2.2.2  牛标准阴性血清样品的检测 分别用4种初筛方法共6种试剂、2种确诊方法共3种试剂对36份标准牛阴性血清进行检测。

结果显示（表3），检测出36份阴性血清、假阳性率为0的有1种方法（试剂）是LY-GICA；检测出8份阴性血清、假阳性率为77.78%的有1种方法（试剂）是ZD-iELISA。检测阴性血清为32份的有1种方法（试剂），检测阴性血清为28份的有1种方法（试剂），检测阴性血清为24份的有2种方法（试剂），检测阴性血清为20份的有1种方法（试剂），检测阴性血清为12份的有1种方法（试剂），检测阴性血清为10份的有1种方法（试剂），检测阴性血清为8份的有1种方法（试剂），假阳性率为11.11%～72.22%。

2.3 布病羊血清差異性检测

2.3.1 羊标准阳性血清样品的检测 分别用3种初筛方法共4种试剂、2种确诊方法共3种试剂对28份标准羊阳性血清进行检测，按照先应用初筛方法全面检测，对结果为阳性的样品再应用确诊方法进行检测，共有12种检测组合。

结果显示（表4），检测出28份阳性血清、假阴性率为0的有2种组合，分别为HP-FPA、BW-cELISA；HP-FPA、SZ-cELISA。检测出14份阳性血清、假阴性率最高达50%的有1种组合，为LY-GICA、ZS-SAT。检测阳性血清为26份的有4种组合，检测阳性血清为24份的有2种组合，检测阳性血清为22份的有1种组合，检测阳性血清为16份的有1种组合，假阴性率为7.14%～42.86%。

2.3.2 羊标准阴性血清样品的检测 对24份标准羊阴性血清，用3种初筛方法共4种试剂、2种确诊方法共3种试剂分别进行检测。

结果显示（表5），检测出24份阴性血清、假阳性率为0的有4种方法（试剂）：ZS-RBT、SZ-GICA、LY-GICA、SZ-cELISA；检测出14份阴性血清、假阳性率为41.67%的有1种方法（试剂）：BW-cELISA。检测阴性血清为22份的有1种方法（试剂），检测阴性血清为16份的有1种方法（试剂），假阳性率为8.33%～33.33%。

3 讨  论

畜间布病是人间布病流行的晴雨表，做好畜间布病防控对人畜健康都有重要意义。近年来随着中国养殖规模的扩大及牲畜、畜产品的大量流通，畜间布病仍未得到有效控制。总体来看，每年的发病数量没有呈现出显著性下降的趋势[19]，布病防控工作任重而道远。当前中国布病防控采取“检疫扑杀和疫苗免疫”相结合的综合防控措施，诊断结果的准确性关乎着防控工作的成功与否。在实际检疫中，诊断方法的选择、诊断试剂敏感性、特异性的差别以及检测人员的操作，都影响着布病诊断的最终结果。

本研究对牛、羊应用布病不同初筛及确诊方法组合的检测差异性结果进行研究、比对分析。选择布病临床诊断中常用的4 种初筛方法共6 种试剂、2 种确诊方法共3 种试剂，依照先初筛再确诊的组合检测方法，对确定的标准牛、羊血清样品进行检测。标准牛阳性血清检测用18种组合方法，阳性符合率为100%的有3种组合，检测结果假阴性率为0～53.33%；标准羊阳性血清检测用12种组合方法，阳性符合率为100%的仅有2种组合，检测结果假阴性率为0～50.00%。标准牛阴性血清用所有方法（试剂）进行检测，阴性符合率为100%的仅有1种方法（试剂），检测结果假阳性率为0～77.78%；标准羊阴性血清用所有方法进行检测，阴性符合率为100%的有4种方法（试剂），检测结果假阳性率为0～41.67%。研究表明，布病初筛方法可优先选择iELISA、RBT、FPA。不同厂家的胶体金方法检测结果间存在显著差异；确诊方法可优先选择cELISA。

本研究应用的诊断方法、商品化的诊断试剂及不同的初筛、确诊组合方法，在实际检测中常会用到，所得的检测结果间却存有较大差异。这些漏检的假阴性样品、误检的假阳性样品，致使传染源进一步传播扩大，或因误杀健康动物造成不必要的经济损失，都制约着布病的有效防控和畜牧业的可持续发展。为避免诊断结果出现的多样性与不确定性[20]，在诊断试剂的监管、评估方面应加强管理，制定全国统一的质量标准要求，保证检验效果，从而确保检测结果的可靠性。

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Abstract In order to explore brucellosis，the methods such aspreliminary screening at first， and then diagnosis confirmation，the differences of reagent combinationresults were used.The RBT， SAT， APHA-cELISA method of the British Brucellosis Laboratory were used as the standard，73 samples of brucellosis positive sera and 60 samples of negative sera  were confirmed with the 133 samples of bovine and sheep serum stored in the laboratory.Four primary screening methods including 6 reagents， and 2 confirmatory methods including 3 reagents were selected，the preliminary screening was done first ， and then the positive results were confirmed， the determined 133 serum samples were tested by 6 methods （9 reagents）.The result showed that 18 kinds of combination methods were used to detect positive sera from cattle， 3 of which had a 100% coincidence rate， and the false-negative rate was 0 to 53.33%;12 combinations  were used to detect positive sera from sheep， and two combinations had a 100% coincidence rate ， the false negative rate of test results was 0-50.00%. Cattle negative serum was tested by all methods，there was 1 method （reagent） with a compliance rate of 100%， and the false positive rate of test results was 0-77.78%;sheep negative serum was tested by all methods and the compliance rate was 100% by use of 4 methods （Reagent）， the false positive rate of test results was 0-41.67%. In this study， different combination methods for preliminary screening and diagnosis were used to detect the same batch of samples， and the results showed diversity. It is recommended that iELISA， RBT， and FPA should be preferred for initial screening of brucellosis， and cELISA should be preferred for diagnosis.

Key words Brucellosis; Preliminary screening; Diagnosis; Difference