LY294002联合顺铂通过细胞自噬效应抑制人喉癌HEP-2细胞的生长

姜玉秋，王頔*，姚远，闫智永，张爽

（1. 沈阳医学院附属第二医院耳鼻喉科，辽宁沈阳 110002；2. 辽宁省人民医院肿瘤二科）

喉癌是头颈部常见恶性肿瘤之一，占全身恶性肿瘤的1%～5%，发病人群以40 岁以上中老年男性为主，也有年轻化趋势，已严重威胁到人们生命健康和生活质量［1-3］。顺铂作为一种重要的肿瘤化疗药物，通过形成Pt-d（GpG）二元加成物破坏癌细胞DNA 而杀伤癌细胞［4-5］。喉癌目前的治疗方案首选手术联合放、化疗，顺铂作为常见的化疗药物常单独或者联合治疗头颈部恶性肿瘤，但因其较大的毒副作用，患者易出现骨髓抑制、胃肠道反应等严重的不良反应，严重限制了顺铂的用药时间及剂量，因此迫切需要寻找毒性较小的临床配伍用药［6-7］。PI3K/AKT/mTOR 信号通路是调节细胞增殖、凋亡抵抗和肿瘤发生的经典通路，参与了多种人类肿瘤细胞自噬的调控［8-9］。研究发现PI3K/AKT 通路抑制剂LY294002 可通过细胞自噬作用提高某些抗肿瘤药物的疗效，减少化疗抵抗［10-11］。本研究探讨LY294002 联合顺铂对人喉癌HEP-2 细胞产生的药理学功效，尤其是细胞自噬在这个过程中所发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人喉表皮样癌细胞株HEP-2 购自美国细胞保存中心（ATCC）；所有细胞培养试剂、DMEM 培养基、胎牛血清、青霉素以及链霉素购自美国Thermo 公司；LY294002、顺铂购自美国Sigma 公司；Muse 细胞活力检测试剂盒购自美国Millipore 公司；高纯度RNA 提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒购自瑞士Roche 公司；Power SYBR Green PCR 预混液、RIPA细胞裂解液购自美国Life Technologies公司；细胞增殖检测试剂盒购自美国Promega 公司；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、蛋白酶抑制剂及其他化学试剂购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 细胞培养 将HEP-2 细胞培养于37 ℃，5%CO2，含15%胎牛血清、100 U/ml 的青霉素、100 μg/ml的链霉素的DMEM培养基中。

1.3 细胞增殖检测 取对数生长期细胞，将浓度为1×104/ml 的HEP-2 细胞接种于96 孔板各孔中，待细胞进行无血清同步化处理后加入（0、1、2、5、10、20及50 μg/ml）LY294002进行孵育，另以（0、0.5、1、2、5、10 及20 μg/ml）DMF 处理组为对照，分别培养24、48 h 后，各孔加入50 μl MTT 继续培养4 h，酶标仪检测490 nm 处的吸光度值，了解细胞增殖情况。

1.4 细胞活力的检测 取对数生长期细胞，将浓度为5×105/ml 的HEP-2 细胞接种于6 孔板各孔中，细胞进行无血清同步化处理24 h 后加入（0、1、2、5、10、20 及50 μg/ml）LY294002 进行孵育，分别培养24、48 h 后，应用Muse Cell Analyzer 全能细胞状态分析仪测定HEP-2 细胞活力。取对数生长期细胞，将浓度为1×104/ml 的HEP-2 细胞接种于96 孔板各孔中，待细胞进行无血清同步化处理后加入2 μg/ml LY294002以及（0、0.5、1、2及5 μg/ml）顺铂进行孵育，另以（0、0.5、1、2、5、10 及20 μg/ml）顺铂处理组为对照，分别培养24、48 h 后，各孔加入50 μl MTT 继续培养4 h，酶标仪检测490 nm 处的吸光度值，了解细胞增殖情况。

1.5 微管相关蛋白1轻链3（LC3B）荧光检测 取对数生长期细胞，将浓度为5×105/ml HEP-2 细胞分别接种于6 孔板各孔中，待细胞铺满率＞75%进行无血清同步化处理，然后进行给药处理24、48 h（药物浓度顺铂为1 μg/ml，LY294002 浓度为2 μg/ml）。LY294002 联合顺铂共同孵育后，用预冷的PBS 清洗各孔5 min×3 次；各孔再加入4%甲醛固定10 min，再次用预冷的PBS 清洗各孔5 min×3 次；室温封闭2 h；LC3B 一抗4 ℃过夜；PBS冲洗5 min×3次，DyLight 488荧光标记的二抗（1∶200 稀释）孵育1 h；PBS 冲洗5 min×3 次，加入DAPI 染色剂复染10 min。最后应用荧光共聚焦显微镜Leica DMI6000B进行荧光观察。

1.6 RNA 的提取和实时荧光定量PCR （RTqPCR） 取对数生长期细胞培养在60 mm 培养皿中，每个接种2.0×107个细胞，待细胞铺满率＞50%时，换无血清培养液培养24 h 进行同步化处理，然后进行给药处理48 h（药物浓度顺铂为1 μg/ml，LY294002 浓度为2 μg/ml）。按照高纯度RNA 提取试剂盒提取总RNA。利用试剂盒进行cDNA 第一条链的合成。按照Power SYBR Green PCR 预混液试剂盒说明书进行操作，25 μl 反应体系包括：1×SYBR Green 染液，上游及下游引物各0.25 mmol/L 以及10 ng cDNA。具体的循环参数为：50 ℃2 min，95 ℃2 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min 进行40 个循环。以GAPDH为内参照计算Ct值，将Ct 值输入相应的数据分析模板，选择合适的参照和分析参数，使用2-ΔΔCt计算基因表达的相对变化。

1.7 统计学方法 采用SPSS 12.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用方差分析、t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LY294002 对HEP-2 细胞增殖的影响 MTT结果显示，与单独培养基设立的空白对照组比较，不同剂量LY294002 对HEP-2 细胞生长的抑制效果不明显。而随着作用时长的延长，LY294002 也未显现出对HEP-2 细胞生长有明显的抑制作用。DMF 也未对HEP-2 细胞的生长有任何的影响。见图1、图2。

图1 MTT检测LY294002（A）和DMF（B）对HEP-2细胞生长增殖的影响（24 h）

图2 MTT检测LY294002（A）和DMF（B）对HEP-2细胞生长增殖的影响（48 h）

2.2 LY294002 对HEP-2 细胞活力的影响 细胞活力检测结果表明，LY294002 处理24 h 时对HEP-2细胞活力的作用效果不明显，死细胞数增加不显著；而当作用时长延长到48 h 时，LY294002 处理对HEP-2 细胞的作用并没有因为时间的延长有所改变，细胞数下降不明显，细胞活力抑制作用仍然较弱。见图3。

图3 LY294002处理24 h（A）和48 h（B）对HEP-2细胞活力的影响

2.3 LY294002 联合顺铂对HEP-2 细胞生长的作用 单独顺铂处理时，低剂量顺铂对HEP-2 细胞无明显毒性反应，当顺铂剂量达到2 μg/ml 以上时，开始对HEP-2 细胞的生长显示出抑制作用；将顺铂和LY294002联合作用HEP-2细胞后，1 μg/ml 剂量的顺铂就可显现出对HEP-2 较强的生长抑制作用。因此决定2 μg/ml LY294002 和1 μg/ml顺铂对喉癌细胞联合作用48 h 为最佳作用时间和最适作用浓度。见图4。

2.4 LY294002 联合顺铂对HEP-2 细胞生长的抑制与细胞自噬效应的关系 LC3B 荧光检测结果显示，在24 h 时，未处理的空白组HEP-2 细胞质中仅有散在的LC3B 抗体标记荧光点； 单独LY294002 处理的HEP-2 细胞也未见大荧光团块出现；单独顺铂处理的细胞荧光显微镜下出现大小不一的荧光团块，LY294002 联合顺铂处理则使HEP-2 细胞质中荧光信号明显增强，呈现大量片状荧光染色区，围绕细胞核遍布整个细胞质区域。孵育48 h 后，空白对照组的细胞形态正常，生长状况良好，LC3B 荧光信号散在分布，无聚集且微弱；单独LY294002 处理对HEP-2 细胞形态及LC3B 荧光点分布无明显变化；经顺铂处理后，细胞发生形态学改变，镜下可见LC3B 荧光信号明显，出现多个明亮绿色荧光；但当LY294002 联合顺铂共同作用后，大部分细胞中能观察到LC3B绿色荧光信号分布，且48 h 孵育后荧光信号强度明显强于24 h孵育后的信号强度。见图5。

图5 LY294002联合顺铂荧光显色结果

2.5 LY294002 联合顺铂诱导HEP-2 细胞自噬发生与某些ATGs 因子的表达有关 RT-qPCR 结果显示，与空白对照组比较，LY294002 和顺铂的联合作用可显著改变ATG3、ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG5 和ATG7 mRNA 的表达量（P＜0.05）。见图6。

图6 LY294002联合顺铂RT-qPCR结果

3 讨论

PI3K/AKT 是参与细胞生长、增殖、分化调节的信号转导通路［12-13］。研究发现，该通路相关蛋白异常表达与肿瘤的发生发展密切相关［14-15］。LY294002作为一种能够特异性阻断PI3K细胞信号传导通路的蛋白激酶抑制剂，可通过启动细胞自噬效应而起到杀伤肿瘤细胞的作用［16-17］。

为了确定LY294002 对喉癌HEP-2 细胞的细胞毒效应，本研究先利用MTT 及细胞活力实验进行检测，结果发现单独LY294002 对喉癌HEP-2 细胞无明显毒性作用，而将0～5 μg/ml 顺铂和2 μg/ml LY294002 联合作用HEP-2 细胞后可显著增强顺铂的杀伤HEP-2细胞效能。

另外，当利用荧光显微镜对细胞内自噬特异性标志蛋白LC3B 表达进行观察时发现，LY294002 联合顺铂对HEP-2 细胞形态学改变较单独顺铂作用效果明显，荧光显微镜下呈现大量片状荧光团块，说明联合作用可极大刺激LC3B的表达，这也进一步证实细胞自噬在其中发挥重要的作用。

细胞自噬一方面起到保护细胞生存的作用，在化疗药物或放疗治疗过程中，癌细胞通过细胞自噬作用降低治疗的敏感度同样也可起到促使癌细胞得以幸存的效果。另一方面，细胞自噬也可参与细胞程序性死亡［18-19］。如果细胞启动的自噬作用强烈或持续时间过长，它可使癌细胞产生不可逆的细胞程序性死亡。细胞自噬的产生与功能性自噬溶酶体的形成密切相关［20］。自噬的2 种途径都需要ATG8家族蛋白与自噬体膜上磷脂酰乙醇胺的共价缀合，其他自噬相关蛋白如（ATG4、ATG12、ATG5、ATG16） 也参与这些途径的调节。本研究发现，顺铂联合LY294002 对ATG3、ATG4A、ATG4B和ATG5 的表达刺激明显。在自噬溶酶体形成后期ATG4A和ATG4B通过去脂化过程（Delipidation）将ATG8 从ATG8-PE 泛素化偶联复合体中剔除，这样去脂化的自噬体才能与细胞质中溶酶体融合形成自噬溶酶体［21-22］。ATG3 可激活LC3 的表达［23］，而ATG5 也参与自噬小泡的形成［24］。这些都证实LY294002联合顺铂对HEP-2细胞的药理作用和细胞自噬效应密切相关。

综上所述，利用人喉癌HEP-2 细胞，探讨了PI3K/AKT 通路抑制剂LY294002 联合传统化疗药物顺铂，通过启动细胞自噬反应抑制喉癌细胞的生长。本实验的研究阐明了顺铂通过与LY294002的联合介导了细胞自噬反应的发生，对于临床抗喉癌药物的选择提供了一定的理论基础。