植物组织培养中污染的产生与防控

颜盟 刘美香

摘   要   随着育苗技术的发展，组培工厂化育苗已是目前最便捷高效的方式之一，但随之而来的问题也日益突出，其中生产中出现的各类污染无疑成为影响育苗效率的大问题。就组培育苗中污染产生的原因进行分析归纳，对症下药，提出有效防治意见。

关键词   组织培养;育苗;污染

组培污染是指在组织培养过程中，由于皮肤、衣服和周围环境中微生物的侵入，在培养容器中大量繁殖，导致培养材料无法正常生长的现象。污染存在于组培生产中的每一个环节，一旦污染发生，将会对组培生产产生严重影响，甚至成为组培工厂化育苗成败的关键。污染主要分为真菌和细菌污染，细菌污染是瓶苗或者培养基上出现黏液状物或不透明水迹，真菌污染常见的是黑、白、黄、红、青等各色霉菌。大多产生在高温高湿的环境中，控制不当或处理不及时，则会导致污染大面积扩散，对生产造成严重影响。

1   污染的产生与危害

1.1   污染的产生   污染由多种因素引起，制剂、接种、洗涤等生产过程均会发生，消杀不彻底的生产环境也会滋生细菌霉菌等。

1）接种操作不规范。接种是培养前最后一个环节，接种时不严格无菌操作，接种环境不清洁，工人防护不到位，接种切苗装瓶时技术不规范，接种台堆放过多材料等物品挡住气流，降低工作台的清潔效率，都会使瓶苗在培养初期出现污染。

2）制剂洗涤。制剂与洗涤为组培生产的准备工作，属于灭菌前流程，若清洗不到位，培养瓶和盖有残存的孢子，或制剂灌装时污染瓶或盖，灭菌不到位，都会产生污染。一般这种污染细菌偏多，会在培养基灭菌后3～5天内产生，出现白色或乳白色团状污染，应及时将其捡出并处理;个别会出现霉菌污染，多是因为灌装时培养基瓶盖未拧好，或灭菌后培养瓶或盖、透气膜等破损，在培养基冷却过程中，环境中的霉菌孢子随着空气的流动进入培养基而产生。

3）外植体的选取与消毒。建立新材料时外植体选取不合适，本身带菌则会在后续扩繁中一直出现内生菌污染;或者外植体选取适宜但消毒不到位也会导致后续接种过程中出现霉菌污染，甚至出现黄色或者白色细菌污染，从而导致新材料建立失败。

4）培养环境不洁净。潮湿温暖的环境容易滋生细菌、霉菌。一般在多雨或者高温季节，如北方的4月、7—8月，培养室因环境湿度、温度的升高易产生大范围霉菌污染，若不能及时治理，会对当年的生产造成严重的损失。

1.2   污染的危害   工厂化育苗时，组培瓶苗出现污染后一般是直接舍弃，不能再继续培养，一旦引起大规模污染将会产生不可挽回的损失，轻则继代大量减产导致后续生产计划推进困难，重则损失掉整个种源，直接停产。

对于保留种源或者实验性用苗，产量少，品质要求高，污染更是杀伤力巨大，会产生不可预估的影响。

2   污染的防治

常态化预防，及时治理，防治同步进行。

2.1   规范接种   接种前换好无菌服、带好口罩帽子、穿接种室专用的无菌鞋;手部用肥皂水清洗多次;用肥皂水清洗接种所用抹布，并用纯净水清洗，在使用前喷适量75%的酒精。随后打开接种台风机，用75%酒精喷洒台面及接种空间，用抹布擦干净台面，包括台面的灭菌器、酒精灯及泡镊桶等，所用培养基及待转接母瓶上接种台前用喷了酒精的抹布擦净瓶身，并擦净双手。接种时使用灭过菌的刀、镊、接种盘或培养皿，刀、镊及刀镊架在酒精灯外焰进行灼烧灭菌，灼烧后取用时手不过刀镊柄，切苗时双手平持刀镊在接种盘外操作，不得竖拿刀镊使双手凌空在接种盘上方。装瓶时，要灼烧培养基瓶口，然后保持培养瓶在酒精灯周15 cm内，瓶盖不得放在双手下方，装苗时苗不可碰触到瓶口，镊子不得伸入到培养基中，封口前瓶口及瓶盖再次用酒精灯灼烧灭菌。

2.2   制剂、洗涤注意细节   在制剂洗涤的过程中，破损及霉菌侵染无法清洗干净的培养容器，及时拣出弃用;灌装机清洗到位，不留卫生死角;灭菌锅定期检修，确保其灭菌质量。在灭菌结束压力降到零后，待锅内稍冷却后再出锅，避免冷空气被倒吸入培养瓶中引起霉菌污染。为防治接种后内生菌的产生，制剂时可加入适宜的抑菌剂。

2.3   严把外植体选择及消毒关   外植体的采摘一般是在连续晴朗的晴天早上9：00前后入园采摘，选择无病虫害、长势健壮的植株，采其顶尖嫩芽部位。消毒时先剪掉较大的叶片，然后在接种台上用1%的升汞消毒6～8分钟，用高温消毒的无菌水清洗后放在无菌瓶中。

2.4   调控适宜的温湿度   根据季节的变化，对生产车间环境的湿度温度进行调控，在高温多雨的季节，及时降温除湿，维持适合培养基存放、瓶苗生长的环境条件。确保培养基不被污染，才能有效降低瓶苗污染率。

2.5   常规清洁到位   日常定时使用臭氧机、紫外灯对接种室、培养室等进行消杀处理，一般建议紫外灯采用时控器定时，早中晚各开灯灭菌半小时，接种台紫外灯可在下班后打开半小时。臭氧机则可以设置为晚上进行工作，避免影响工作人员。另外，生产车间要做好日常卫生，及时拣出污染瓶苗，在指定地方处理污染，并将污染瓶先用消毒液浸泡，再常规清洗，可用84消毒液或新洁尔灭，有条件的可以在倒掉污染瓶苗前先高温高压消毒。及时处理废弃瓶苗、垃圾，日常用新洁尔灭对环境进行常规消杀。

2.6   定期消杀预防   对容易滋生污染的环境针对性防治。定期对生产车间消毒，传统的消毒方法有甲醛熏蒸，该方法灭菌效果最好，但因甲醛对人体危害较大，且熏蒸时所用甲醛纯度较高，所以熏蒸后一定要彻底通风。也可选用其他消毒溶液，选择适宜于自家车间的，科学配比，既减少对员工的健康威胁，又确保车间环境消杀到位。定期保养、清理接种台过滤网，避免使用时间过长或者保养不到位，滤网坏掉或者积灰严重，影响过滤效果，产生污染。

3   小结

总体来说，导致植物组织培养污染的原因，可概括为两个方面，一是生产环节操作不当，包括但不限于制剂、接种、洗涤等;二是培养环境消杀不到位，包括日常各个车间的常规、定期消杀等。污染的防治则是以日常预防为主，防治结合，根据污染产生的原因，采取针对性措施，对症下药，确保污染及时被控制。