二代测序技术在假体周围感染诊断中的应用

林丽琼，肖莉莉，冯尔宥，林 煜，张怡元

（福州市第二医院骨科，福建 福州 350007）

人工全关节置换（total joint replacement）是骨关节疾病终晚期有效的治疗方法[1]。人工关节感染（PJI）是人工关节置换术后可能发生的严重并发症，初次关节置换的发生率为1%～2%，而在翻修患者中为5%～40%[2]。PJI 影响患者生活质量，出现关节疼痛、功能受损，甚至死亡[1]。多种病原菌可引起PJI，其中主要为革兰氏阳性菌，特别是葡萄球菌属[3]，在PJI 治疗中，及时和精确诊断是至关重要的。然而，传统细菌培养敏感性较低，对于培养阴性的感染，易被漏诊。临床中常通过获取多个样本，利用不同的无菌设备进行采集，提高样本送检速度，以及延长培养时间等方法来提高传统细菌培养的敏感性[4]。但实际工作中，PJI 中传统细菌培养阴性率为7%～42.1%[5]。同时，传统细菌培养较为耗时，因此，迫切需要一种更快捷且敏感的诊断方法来帮助早期诊断。二代测序（Next-Generation Sequencing，NGS）是一种新型开发的基于基因序列的病原体微生物鉴定方法，已应用于PJI 诊断中[6-9]。为了更好地挖掘二代测序在PJI 患中检测的诊断效用，本研究拟探讨二代测序在PJI 诊断方面中的效用和功效，并将其与传统的诊断程序进行比较，旨在为PJI 的早期诊断拓展新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019 年8 月-2022 年1 月福州市第二医院收治的需要进行人工关节翻修患者46 例，其中男性21 例，女性25 例：年龄43～82 岁，平均年龄（64.62±2.08）岁；其中髋关节翻修34 例，膝关节翻修12 例，根据根据肌肉骨骼感染协会（MSIS）第二届国际共识会议（ICM 2018，https://icmphilly.com）诊断标准分为无菌性松动组21 例和假体周围感染组25 例。无菌性松动组：ICM 评分＜3 分或ICM 评分为3～5 分且二代测序为阴性。假体周围感染组：ICM 评分≥6 分或ICM 评分为3～5 分且二代测序为阳性。其中，无菌性松动组男9 例，女12例：年龄52～81 岁，平均年龄（66.24±11.62）岁；假体周围感染组男12 例，女13 例：年龄43～82 岁，平均年龄（65.19±8.28）岁，两组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究已通过医院伦理委员会审批，患者知情同意。

1.2 方法 采集研究对象外周静脉血，测定血清白细胞（WBC）、C 反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR）和D-二聚体，术前进行关节腔穿刺获得关节液进行关节液白细胞计数（synovial WBC），关节液多形核细胞计数（synovial PMN）测定；术中取假体周围滑膜组织于无菌管中，分别进行14 d 的传统细菌培养及二代测序。其中用于二代测标序标本，通过物理破壁后，酶破壁混合震荡后提取DNA，使用MGISEQ-2000 系统（MGI Tech Co.,Ltd.）进行测序[10]，通过BWA（BWA:http://bio-bwa.sourceforge.net/）与华大PMDB 病原数据库进行比对，根据序列数的高低、检测深度、检测离散度及基因组覆盖度来判断可能的病原体。

1.3 统计学方法 采用IBM SPSS 25（Armonk，NY，USA）统计软件进行分析。计量资料用（）表示，采用t检验。采用受试者工作特征曲线（receiver operating curve，ROC）并计算每条ROC 曲线下面积，评价诊断性能（AUC-ROC），以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清和滑液生物标志物比较 假体周围感染组WBC、CRP、ESR、Synovial WBC、Synovial PMN 均高于无菌性松动组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 患者血清和滑液生物标志物比较（）

表1 患者血清和滑液生物标志物比较（）

注：与无菌性松动组比较，*P＜0.05

2.2 血清和滑液生物标志物诊断比较 血清和滑液生物标志物AUC 面积均大于0.5，其中CRP 诊断效能最大，其次为Synovial WBC 和Synovial PMN，见表2、图1。

图1 WBC、CRP、ESR、Synovial WBC 和Synovial PMN 诊断的ROC 曲线

表2 生物标志物AUC 和Cut-off 值

2.3 细菌培养、二代测序、细菌培养与二代测序联合诊断比较 细菌培养与二代测序联合诊断效能优于二代测序，优于传统细菌培养，敏感性、准确度较高，假阴性率较低，但假阳性率较高，见表3、图2。

图2 细菌培养、二代测序、细菌培养与二代测序联合诊断的ROC 曲线

3 讨论

PJI 病原菌的诊断一直是一个临床挑战[11]。二代测序辅助PJI 诊断在临床的普遍应用，被认为是PJI诊断中一个有效工具，尤其适用于培养结果阴性或着抗生素使用史的患者[6，7]。但部分学者认为，与传统培养相比，二代测序并没有提供足够优越的敏感性和特异性[8]，其在PJI 中的诊断价值值得商榷。因此，为了更好地挖掘二代测序在PJI 患中检测的诊断效用，本研究探讨二代测序技术在PJI 诊断方面中的效用和功效，并将其与传统的诊断程序进行比较。

WBC、CRP、ESR 和D-二聚体等血清生物标志物是常用于鉴别全髋关节或膝关节置换术后假体周围感染与无菌性松动的诊断指标[12]。血清生物标志物可以提供术前信息，易获得且价格低廉。然而其敏感性及特异性的最佳阈值仍存在争议，其中血CRP 水平的范围很广（1.2～32.0 mg/L），敏感性为78%～90.2%，特异性为64.8%～95.7%[13-16]。本研究中Cut-off 为3.405 mg/L，敏感性为1.000，特异性为0.667。然而，由于血清生物标志物是全身性的参数，因此特异性较低[12]，易受到患者基础疾病、术前病因等诸多因素影响，从而可能影响诊断结果[17，18]。因此，需要新技术和生物标志物提高诊断的准确性[19，20]，如关节液分析、深层组织微生物学、病理及超声裂解液分析等，其中关节液WBC 和关节液PMN%较为常用。在一项多中心研究中，关节液WBC 计数和PMN 阈值分为3966 cells/μl 和80%[21]。本研究中关节液WBC 计数Cut-off 值为5658.5 cells/μl，关节液PMN%为82.00%，略高于文献报导水平。

在本研究中，二代测序、细菌培养与二代测序联合诊断分析显示，敏感性为78.26%和81.82%，AUC值为0.829、0.849，在0.5～1 的范围内，而传统细菌培养AUC 值为0.740。虽然二代测序和细菌培养的AUC 值低于CRP、Synovial WBC 和Synovial PMN，然而CRP 和关节液分析无法进行病原菌检测。与传统细菌培养相比，二代测序、细菌培养与二代测序联合诊断具有更高的敏感性、准确度，及较低假阴性率。根据文献统计，PJI 患者中5%～45%传统细菌培养为阴性[22]，导致培养结果阴性原因包括低毒性病原菌、抗生素使用史以及培养条件。对于细菌培养阴性PJI 患者，二代测序技术的检出率大于50%（范围为82%～100%）[23，24]，二代测序技术有可能成为细菌培养阴性的PJI 患者有效的诊断工具。除此，二代测序技术可在一次分析中检测出细菌、真菌和病毒病原体，并做出具有统计学意义、定量、无偏见的、有针对性、敏感且特异的结果[25]。然而，二代测序技术作为常规诊断手段具有一定的局限性，相较于传统细菌培养，费用较高，亦不能提供抗生素敏感性报告。此外，本研究样本量不大，且缺乏对于高通量检测序列数与感染程度的相关性探讨，以及序列数判别分析。一些实验室指标，如滑膜α-防御素和关节液CRP，由于缺少评估条件，因此缺少相关数据[26]。

综上所述，二代测序技术作为一种新型诊断工具，较传统细菌培养更高的敏感性、准确度，为假体周围感染病原学诊断提供有力帮助。