生脉散对H2O2 损伤PC12 细胞保护作用的研究

谭晓君，杨心怡，张雪杨，刘 薇，刘 昆，罗楚萱，刘小柳，吴都督，陈 稚

（1.广东医科大学药学院，广东 东莞 523808；2.深圳罗湖人民医院医学实验室，广东 深圳 518002）

阿尔兹海默症（Alzheimer disease，AD）是一种起病隐匿的神经系统退行性疾病，其发病率逐年上升。国际阿尔茨海默病协会（ADI）在2021 年阿尔兹海默症的报告中指出，全球有超过5500 万人患有失智症[1]，该病已成为现代社会健康难题。褪黑素是目前临床上防治AD 常见的抗氧化剂，但其不能从根本上治疗AD，并且具有不可忽视的副作用[2]。因此，研究开发新的防治AD 的抗氧化剂尤为重要。许多中药或中药提取物都具有抗氧化的作用，并展示出其作为抗氧化剂对于治疗AD 的巨大潜力[3]。中药提取物成分具有较高的活性以及较少的副作用等优势，能从多个途径来抑制氧化应激导致的神经元凋亡[4，5]。黄芪主要有效成分可通过多种途径来保护氧化损伤的PC12 细胞[6]，红景天苷不仅可以清除自由基，保护氧化损伤的神经细胞[7]，地黄饮子可以减少线粒体损伤导致的氧化应激，减少脂质过氧化，抵抗过度的自由基带来的损伤[8]。生脉散（Shengmai-san，SMS）是有800 余年历史的经方，源自于《医学启源》卷下：“补肺中元气不足”，其组成有人参、麦冬、五味子等。三药合用，具有益气养阴、保肺生脉的功效，是补肺养心的经典方[9]。《医方论·卷三·清暑之剂》所云：“肺主气，心主血，生脉散养心肺之阴，使气血得以荣养一身”。现代药理研究表明[10]，SMS 能改善神经系统，并具有抗氧化的作用。近年来，许多研究者探讨了关于SMS 抗氧化和改善老年痴呆的作用。由于PC12 细胞常被用于构建氧化应激损伤的细胞模型[11，12]。因此，本实验拟以PC12 细胞为模型，观察SMS 对PC12 细胞增殖的影响，检测氧化损伤前后PC12 细胞各指标量的变化，并探讨SMS 保护PC12细胞氧化应激损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人参、麦冬、五味子（广东时珍制药有限公司）；神经细胞株PC12 细胞（上海细胞库）；L-DMEM、H-DMEM 培养基（美国GIBCO 公司）；磷酸盐缓冲溶液（PBS，Solarbio 公司）；胎牛血清（FBS，美国GIBCO 公司）；含EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液（吉诺生物公司）；H2O2溶液（分析纯，Sigma）；CCK8试剂盒（日本同仁化学研究所）；二甲基亚砜（DMSO，Solarbio 公司）；细胞裂解液（RIPA，Solarbio公司）；PMSF 蛋白酶抑制剂（贝博生物公司）；BCA法蛋白定量试剂盒（Thermo Scientific 公司）；6×SDS-PAGE 蛋白上样定量试剂盒（江苏碧云天生物研究公司）；丙二醛（MDA）试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定试剂盒（均来自南京建成生物工程研究所）；聚偏二氟乙烯膜（PVDF，美国Milipore 公司）；一抗（兔抗鼠IgG，CST 公司）；二抗（荧光标记的山羊抗兔IgG，CST 公司）；脱脂奶粉（BD 公司）。电子分析天平（美国Sartorius 公司）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司/5840R 型）；常温及低速离心机（德国Eppendorf 公司）；涡旋混匀仪（北京六一仪器厂）；恒温水浴锅（金坛市杰尔瑞电器有限公司）；-80 ℃超低温冰箱（Thermo Scientific 公司）；细胞恒温培养箱（Thermo Scientific 公司）；BiovTek synergy 多功能酶标仪（BiovTek 公司）；WB 红外显影仪（美国Gene Company Linited 公司）；DYCP-24DN 电泳仪（北京六一仪器厂）；垂直电泳转膜系统（Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 SMS 的制备 按生脉散配方比例即人参15.6 g、麦冬9.4 g、五味子4.7 g，称取定量药材于5 倍量的75%乙醇中，浸泡120 min 后加热回流2 h，收集滤液。往滤渣中加入5 倍量的75%乙醇，加热回流2 h后收集滤液。将收集的2 次滤液混合，过滤并浓缩，获得浓度为10 g/ml 的SMS 母液。

1.2.2 SMS 对PC12 细胞增殖的影响 通过CCK8 法检测SMS 对PC12 细胞存活率的影响。将培养至对数生长期的PC12 细胞消化并离心处理，用血球计数板进行细胞计数，按每孔5000 个细胞加入96 孔培养板，每孔100 μl，在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h。用DMEM 溶解稀释SMS，配制成0.1、1.0、5.0 g/ml的低、中、高剂量组，每组浓度设置3 个复孔，在上述条件下培养。空白对照组用DMEM 做相同处理。培养24、48、72 h 后，每孔加入10 μl CCK8 试剂，摇匀，在37 ℃条件下孵育1 h。用酶标仪在450 nm 处测OD 值。取3 个孔的均数，细胞活力（%）=（实验孔均值/对照孔均值）×100%。

1.2.3 CCK8 检测 SMS 对PC12 细胞氧化损伤的保护作用将处于对数生长期的PC12 细胞按每孔5000个加入96 孔板，每孔体积为100 μl，在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。实验分为5 组：空白对照组、H2O2损伤模型组（200 μmol/L H2O2）、SMS 低剂量组：SMS（0.1 g/ml）+H2O2（200 μmol/L）、SMS 中剂量组：SMS（1.0 g/ml）+H2O2（200 μmol/L）、SMS 高剂量组：SMS（5.0 g/ml）+H2O2（200 μmol/L）。反应24 h 后，加入10 μl CCK8 试剂，37 ℃条件下反应1 h 后，用酶标仪在450 nm 处测OD 值。细胞活力（%）=（试验孔均值/对照孔均值）×100%。

1.2.4 检测PC12 细胞上清液中LDH、MDA 含量和SOD 活力 在构建H2O2损伤模型过程中，PC12 细胞内的LDH 释放到胞外，由于活细胞无法释放LDH，因此通过检测细胞外LDH 的含量从而反映PC12 细胞的损伤程度。收集1.2.3 处理后的细胞培养液，分别参照3 个测试盒说明书进行操作，随后用酶标仪在对应波长即在450、530、450 nm 处测定OD 值并根据相应公式计算LDH、MDA 含量及SOD活力。

1.2.5 SMS 对PC12 细胞的核因子E2 相关因子2（Nrf-2）蛋白表达水平的影响 将PC12 细胞按密度为3×106个/ml 接种于6 孔板，分别设置空白对照组、H2O2损伤模型组、SMS+H2O2组、SMS 组。孵育24 h 后弃上清，PBS 洗2 次后用吸水纸吸干，放置于冰上。每孔加80 μl 蛋白裂解液，并放置在冰上裂解30 min。将细胞碎片与裂解液用细胞刮刮至一侧，并转至1.5 ml EP 管（1.2×104r/min、4 ℃）离心10 min。取其中2.5 μl 上清液用BCA 法测定其蛋白浓度，剩下液体转移至1.5 ml EP 管中-80 ℃下保存备用。取50 μg 蛋白，使用10%SDS 聚丙烯凝胶电泳进行分离后，转至PVDF 膜上，并用脱脂奶粉进行封闭，加入相应的一抗，4 ℃过夜。PBST 洗膜，加入荧光二抗，室温反应2 h，用红外荧光成像系统显色。

1.3 统计学方法 应用SPSS 24.0 统计软件进行数据分析，计量资料用（）表示，进行单因素方差分析和Newman-keuls 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SMS 对PC12 细胞增殖的影响 与空白对照组比较，PC12 细胞存活率随SMS 作用时间的延长而增高，随SMS 含量的增多而增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中在同一含量比较下，SMS 各含量组72 h 的细胞存活率均比48 h 的高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 SMS 对PC12 细胞存活率的影响（，%）

表1 SMS 对PC12 细胞存活率的影响（，%）

注：同一时段，与对照组比较，aP＜0.05；同一含量组，与24h 比较，bP＜0.05，cP＜0.05

2.2 SMS 对H2O2诱导损伤后的PC12 细胞存活率的影响 与空白对照组比较，损伤模型组中H2O2对PC12 细胞杀伤性较大，其细胞存活率降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；SMS 低、中、高剂量组的细胞存活率比H2O2损伤模型组高，且呈现出含量依赖性，SMS 含量越高，细胞存活率也相应提高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 SMS 对H2O2 诱导损伤后的PC12 细胞存活率的影响（，%）

表2 SMS 对H2O2 诱导损伤后的PC12 细胞存活率的影响（，%）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与H2O2 损伤模型组比较，bP＜0.05

2.3 SMS 对H2O2诱导PC12 氧化损伤后细胞上清液中LDH，MDA 及SOD 的影响 与空白对照组比较，H2O2损伤模型组细胞上清液中LDH 活性、MDA 含量增加，SOD 活力减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）；与H2O2损伤模型组比较，SMS 低、中、高剂量组可降低损伤后的PC12 细胞培养液中LDH 活性和MDA 含量，差异有统计学意义（P＜0.05）；同时能有效地改善PC12 细胞培养液中SOD 的活力水平（P＜0.05）；此外，随SMS 含量的增多。LDH 活性减弱、MDA 含量降低，SOD 活力则提高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 SMS 对H2O2 诱导PC12 氧化损伤后细胞上清液中LDH，MDA 及SOD 的影响（）

表3 SMS 对H2O2 诱导PC12 氧化损伤后细胞上清液中LDH，MDA 及SOD 的影响（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与H2O2 损伤模型组比较，bP＜0.05

2.4 SMS 对H2O2诱导PC12 细胞内MDA 含量及SOD 活力的影响 与空白对照组比较，H2O2损伤模型组的PC12 细胞内MDA 含量增大，而SOD 活力降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与H2O2损伤模型组比较，SMS 各含量组均可使PC12 细胞内MDA含量降低，使SOD 活力增高。而随着SMS 含量的增大，MDA 含量降低，SOD 活性显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 SMS 对H2O2 诱导PC12 细胞内MDA 含量及SOD 活力的影响（）

表4 SMS 对H2O2 诱导PC12 细胞内MDA 含量及SOD 活力的影响（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与H2O2 损伤模型组比较，bP＜0.05

2.5 SMS 对PC12 细胞Nrf-2 核蛋白表达水平的影响 与空白对照组比较，SMS 组的Nrf-2 核蛋白表达增强，H2O2损伤模型组Nrf-2 核蛋白表达下降。与H2O2损伤模型组比较，SMS+H2O2组对PC12 细胞核中Nrf-2 蛋白的表达具有上调作用。SMS 组中Nrf-2 核蛋白也比SMS+H2O2组的表达高，见图1。

3 讨论

研究发现，SMS 对多种疾病均有一定的药理作用，而SMS 对心肌氧化损伤的保护作用、对阿尔兹海默症的预防作用以及抗氧化作用是当前的研究热点[13]。高歌等[14]通过分子对接技术发现SMS 中防治心脏氧化损伤的最佳活性成分。王熙林[15]对SMS 进行体外抗氧化能力实验，发现SMS 提取液具有抗氧化作用。林善花[16]探究AD 大鼠口服SMS 后血中的移行成分能被辨识并分析。卢盛文等[17]发现SMS 干预AD 大鼠的药效物质基础能被中医方证代谢组学技术所分析。然而，这些研究基本都只是集中在生脉散的物质基础上，关于生脉散抗氧化和改善AD的具体机制却并不清楚。因此，本实验探讨了SMS保护PC12 细胞氧化应激损伤的作用机制。

目前，关于阿尔兹海默症的发病机制尚未研究透彻，自由基假说中阐述其致病机制与氧化应激有一定的联系[18]。有文献报道[19，20]，阿尔兹海默症患者免疫力低下，其神经元细胞膜产生大量的自由基，损伤生物膜和细胞器，神经细胞长期处于氧化应激的状态。研究表明[21]，当细胞受损时，其胞外LDH 活性会增强，MDA 可作为脂质过氧化程度以及清除自由基能力的指标，SOD 可反映细胞内的抗氧化能力。本研究中CCK8 测定结果显示，与H2O2损伤模型组比较，SMS 各含量组的细胞存活率上升，说明SMS对氧化损伤的PC12 细胞具有保护作用。此外，本研究通过胞外LDH 活性、胞内外MDA 含量及SOD 活力的测定，结果显示为胞外LDH 活性减弱，胞内外MDA 含量均减少以及SOD 活力均增强，说明SMS能修复细胞膜的损伤，减少脂质过氧化，并增强自由基清除与抗氧化能力，即SMS 可作为抗氧化剂来帮助细胞抵抗由氧化应激导致的损伤。

Nrf-2 是CNC 转录因子家族中活力最强的转录调节因子，诱导Nrf-2 因子的活化在PC12 细胞抵抗氧化应激损伤中起到非常关键的作用[22]。本研究结果中，与对照组比较，H2O2损伤模型组的PC12 细胞核中Nrf-2 蛋白的表达下调，说明模型组中Nrf-2因子受到抑制，其抵抗氧化损伤的自我保护能力大大减弱；而经过SMS 的处理之后，胞核内Nrf-2 蛋白的表达上调，说明SMS 能解除模型组中Nrf-2 因子的抑制状态，并增强细胞抵抗氧化损伤的能力。此外，与对照组比较，SMS 组中的Nrf-2 因子的表达上调，说明SMS 能激活细胞内更多的Nrf-2 因子，从而增强抗氧化的自我保护能力。

综上所述，SMS 对H2O2氧化应激损伤的PC12 细胞具有保护作用，其作用机制可能与SMS激活Nrf-2 转录因子，上调Nrf-2 蛋白表达有关，说明SMS 可作为抗氧化剂来保护损伤的PC12 细胞，为SMS 治疗阿尔兹海默病提供了一些理论和实验依据。