UPLC-MS/MS法同时快速测定保健食品中7种非法添加药物

吴芳海 许琨琨 卢文斌 王晓峰 蔡振世

摘 要：目的：建立同时快速测定保健食品中阿伐那非、米罗那非、乌地那非、西地那非、他达拉非、沙格列汀和西布曲明等7种非法添加药物的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。方法：试样前处理采用乙腈为提取溶剂，经超声处理，Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱分离，以水（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）为流动相梯度洗脱，流速0.3 mL·min-1，柱温30 ℃，进样量2 μL。质谱采用电喷雾离子源，以正离子多反应监测模式进行定性和定量分析。结果：7种非法添加药物在本方法色谱和质谱条件下8 min内能得到快速分离，在10～500 ng·mL-1线性关系良好，相关系数R为0.997 1～0.999 2，检出限为0.002 5 mg·kg-1。结论：本方法前处理过程简单快速，选择性强，灵敏度高，能够快速、准确地同时对保健食品中非法添加的阿伐那非、米罗那非、乌地那非、西地那非、他达拉非、沙格列汀和西布曲明进行定性及定量测定。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）；保健食品；非法添加

Abstract： Objective： To establish an UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of avanafil， mirodenafil， udenafil， sildenafil， tadalafil， saxagliptin and sibutramine in health food. Method： Samples was extracted with acetonitrile and handled by ultrasound， used Waters ACQUITY UPLC?BEH column C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） with mobile phase of water （contain 0.1% formic acid） and acetonitrile （contain 0.1% formic acid） by gradient elution ; the flow rate was 0.3 mL·min-1， the column temperature was 30 ℃， and the sample volume was 2 μL. ESI （electro spray ion source） was used for mass spectrometry， and positive ion multiple reaction monitoring mode was used for qualitative and quantitative analysis. Result： Seven illegally added drugs can be separated rapidly in 8 minutes under the conditions of this method， each component has a good linear relationship within the range of 10～500 ng·mL-1， the correlation coefficient R was between 0.997 1 and 0.999 2， the detection limit was 0.002 5 mg·kg-1. Conclusion： The pretreatment process of this method is simple and rapid， high selectivity， high sensitivity， it can be used as a rapid and simultaneous determination method for the illegally addition of avanafil， mirodenafil， udenafil， sildenafil， tadalafil， saxagliptin and sibutramine in health food.

Keywords： ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; health food; illegally added

近年来，随着生活水平的提高，消费者对保健食品的需求也越来越强烈，其中补肾壮阳、降糖、减肥等热门功效的保健食品尤其受到消费者的追捧，虽然目前与保健食品相关的法律法规越来越完善，保健食品行业日常监管也日趋规范，但由于保健食品行业有着高热度、高需求、高利润等特点，在高额利益的驱使和诱惑下，保健食品中非法添加药物的现象屡禁不止，如西地那非、他达拉非、西布曲明这些常见药物在日常监管中时有检出。为了逃避监管，甚至会添加一些并不常见的药物成分或者同时添加多种不同功效的药物，隐蔽性越来越高，严重危害广大消费者的身心健康，因此本文在西地那非、他达拉非、西布曲明等常見的药物之外，补充开发了阿伐那非、米罗那非、乌地那非和沙格列汀等新型药物的检测方法[1-5]，扩大了保健食品中非法添加物质的检测范围，增加保健食品中非法添加物质的检测项目，提高检测效率，为监管部门整治行业乱象提供更多的技术支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 实验试剂与对照品

乙腈（色谱纯，德国merck）；甲酸（色谱纯，美国ROE）；水为超纯水（由超纯水器制备）；阿伐那非对照品（批号：S076065，Fist Standard）；米罗那非对照品（批号：ALT800166，Fist Standard）；乌地那非对照品（批号：FS1610680，Fist Standard）；西地那非对照品（批号：510068-202102，中国食品药品检定研究院）；他达拉非对照品（批号：510170-202102，中国食品药品检定研究院）；沙格列汀对照品（批号：FS1621842，Fist Standard）；西布曲明对照品（批号：100624-201802，中国食品药品检定研究院）；固体阴性供试品，某牌蛋白粉；液体阴性供试品：某牌铁锌钙硒氨基酸口服液。

1.1.2 仪器

Triple Quad 5500超高效液相色谱串联质谱仪，美国SCIEX公司；3-15台式离心机，曦玛离心机扬州有限公司；Dirent-Pure UP UV30超纯水一体机，上海乐枫生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速：0.3 mL·min-1；进样量：2 μL；柱温：30 ℃；流动相：A相为水（含0.1%甲酸），B相为乙腈（含0.1%甲酸），采用梯度洗脱见表1。

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源，正离子扫描；采集方式：多反应监测模式；气帘气：20.0 psi；碰撞气：9 psi；离子化电压：5 500.0 V；温度：500.0 ℃。喷雾气：50 psi；辅助加热气：50 psi；7种分析物的详细质谱参数见表2。

1.2.3 混合对照品标准曲线的制备及测定

分别精密称取适量阿伐那非、米罗那非、乌地那非、西地那非、他达拉非、沙格列汀和西布曲明对照品于同一容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成浓度为5 μg·mL-1的混合对照品溶液，分别精密移取混合对照品溶液0.02 mL、0.04 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL和1.00 mL置于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，即得浓度为10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、300 ng·mL-1和500 ng·mL-1系列标准溶液，按上述检测条件进行测定，以对照品溶液的浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.4 供试品溶液的制备与测定

精密称取一次服用量供试品（固体样品研细），置于50 mL离心管中，加乙腈20 mL，涡旋振荡1 min，超声处理15 min，冷却至室温，5 000 r·min-1离心5 min，将上清液转移至50 mL容量瓶中，向沉淀中再加入20 mL乙腈，重复提取1次，合并两次提取上清液于同一50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，过滤，即得供试品溶液。

不少保健食品中非法添加的药物含量较高，为避免过高浓度的分析物组分污染质谱系统，检测过程中应当先稀释较大倍数溶液进样，然后根据实际检测结果调整至合适的稀释倍数再进行测定[4]。

2 结果与分析

2.1 专属性试验

分别取浓度为100 ng·mL-1的混合对照品溶液和加标供试品溶液（浓度为100 ng·mL-1），按1.2的条件测定，记录7种分析物的定量离子提取离子流色谱图见图1、图2。结果显示加标供试品溶液中7种组分的保留时间与混合对照品溶液一致，各组分分离效果和专属性良好。

2.2 方法的线性范围和检出限

取某牌蛋白粉阴性供试品一次服用量（10 g），精确加入5 μg·mL-1的混合对照品溶液0.10 mL，按上述1.2.4方法步骤处理，即得每毫升含1 0 ng混合对照品的樣品溶液，再分别稀释成各浓度检测，以信噪比为3的溶液浓度计算各分析物的方法检出限，试验结果表明7种分析物在10～500 ng·mL-1线性关系良好，检出限能达到0.002 5 mg·kg-1，本方法可满足其检测分析的需求。各分析物的线性和检出限结果见表3。

2.3 加样回收率试验

分别取固体样品（某牌蛋白粉）和液体样品（某牌铁锌钙硒氨基酸口服液）各6份（每份10 g），精确加入5 μg·mL-1的混合对照品溶液1 mL，按上述1.2.4方法步骤处理，制备成添加量为0.5 mg·kg-1的添加回收试样溶液，测定结果计算平均回收率，结果见图3。

由图3可知米罗那非、乌地那非、西地那非、他达拉非、沙格列汀和西布曲明按本方法测定固体和液体两种基质样品中的平均回收率结果为93.3%～118.4%，准确性和稳定性较好，阿伐那非的回收率达到了135%以上，计算100 ng·mL-1浓度的阿伐那非在固体和液体两种阴性基质溶液中的峰面积与纯溶剂中的峰面积比分别为114%和122%，均大于100%，存在一定的基质增强效应[6]，可考虑采用配制基质匹配标准曲线的方法来降低样品基质对阿伐那非的影响。

2.4 重复性试验

记录2.2中加标回收试样溶液所测得的色谱峰面积，计算RSD结果，在固体样品（某牌蛋白粉）和液体样品（某牌铁锌钙硒氨基酸口服液）中7种分析物的RSD分别为1.9%～8.8%和1.6%～6.1%，表明本方法在固体样品和液体样品的检测中具有良好的重复性，具体结果见表4。

2.5 实际样品检测

采用本方法对71批保健食品（泉州市食品药品检验所提供）进行测定，其中8批保健食品检测出西地那非，含量差异较大，最低为25 mg/粒，最高为101 mg/粒，检出率为11.3%，1批保健食品检出他达拉非，添加量为42 mg/粒，检出率为1.4%，1批保健食品检出西布曲明，添加量为39 mg/粒，检出率为1.4%，其余样品未检测出上述7种成分。

3 结论

本法采用乙腈为提取溶剂，高效液相色谱-串联质谱法测定，建立了能够同时快速测定保健食品中阿伐那非、米罗那非、乌地那非、西地那非、他达拉非、沙格列汀和西布曲明等7种非法添加药物的测定方法，对方法的线性范围、试样加标回收率、精密度和检出限等进行验证和评价，并对多种实际的保健食品样品进行了测定，结果准确检出了含有西地那非、他达拉非、西布曲明等多种类不同功效的非法添加药物成分，方法操作简便、分离效能高、专属性强、结果准确可靠，显著缩短了分析时间，能够满足实验室同时对上述7种不同功效的保健食品非法添加药物的快速测定工作，也为市场监管部门对保健食品非法添加药物监督管理的快速响应提供有力的技术支持。

参考文献

[1]吴鸳鸯，王任，周明昊，等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定保健食品中阿伐那非与氟班色林含量[J].医药导报，2017，36（7）：783-785.

[2]边海涛，张雨萌，勇艳华，等.高效液相色谱-串联质谱法快速测定保健食品中4种降血糖类药物[J].食品与机械，2022，38（2）：46-50.

[3]万远航，李静.UPLC-MS/MS法快速检测保健食品中非法添加西地那非等化学药物成分[J].中国检验检测，2021，29（3）：16-18.

[4]韩瑨烜，寇雷，李勇，等.UPLC/MSMS快速筛查减肥类保健食品中6种违禁药物[J].食品工业，2022，43（7）：303-306.

[5]朱捷，何微，马桂娟.HPLC-MS/MS法同时测定补肾壮阳类保健食品中非法添加11种化药成分[J].当代化工，2015，44（11）：2729-2732.

[6]李锦清，綦艳，郦明浩，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定保健品中三种违禁成分[J].现代食品科技，2014，30（11）：246-250.