气相色谱法测定咖啡生豆中硫丹及硫丹硫酸酯残留

蒲泓君 邓洪燕 满红平

摘 要：建立气相色谱测定咖啡中α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯残留的方法。咖啡粉末样品经过乙腈超声提取，离心后上清液依次经安捷伦增强型除脂分散净化管EMR-Lipd、1.6 g硫酸镁和0.4 g氯化钠和弗罗里硅小柱净化，50 ℃氮吹仪上浓缩至近干，加入1.00 mL正己烷复溶，用毛细管柱气相色谱分离测定。3种有机氯农药在0.01～0.50 ?g·mL-1线性相关性良好，相关系数均大于0.995，检出限为0.002 2～0.004 4 mg·kg-1，测定下限为0.01～0.02 mg·kg-1。在0.02～0.10 mg·kg-1的加标水平下，3种农药的加标回收率为80.1%～94.1%，相对标准偏差为2.4%～9.1%。因此，该方法前处理对咖啡油脂的净化较佳，准确度和精密度满足实验室要求，可用于定性及定量检测咖啡中硫丹及其代谢物农药残留。

关键词：气相色谱法；硫丹及其代谢物；咖啡生豆

Abstract： A gas chromatography method for the determination of α-endosulfan， β-endosulfan and endosulfan sulfate residues in coffee was established. The coffee powder samples were ultrasonic extracted by acetonitrile extraction. After centrifugation， the supernatant was purified by Agilent enhanced EMR-Lipd， 1.6 g magnesium sulfate， 0.4 g sodium chloride and Flori silicon column， concentrated to nearly dry on a nitrogen blower at 50 ℃， and 1.00 mL n-hexane was added for resolution. The capillary column was separated by gas chromatography， and the retention time and peak area were qualitatively determined by electron capture detector. The three organochlorine pesticides had good linear correlation in 0.01～0.50 ?g·mL-1， and the correlation coefficients were all greater than 0.995. The limit of detection  was 0.002 2～0.004 4 mg·kg-1， and the limit of quantitation was 0.01～0.02 mg·kg-1. The recoveries ranged from 80.1% to 94.1% and the relative standard deviations ranged from 2.4% to 9.1% at 0.02～0.10 mg·kg-1. Therefore， the method can be used for qualitative and quantitative determination of endosulfan and its metabolites pesticide residues in coffee， and its accuracy and precision meet the laboratory requirements.

Keywords： gas chromatographic method; endosulfan and its metabolites; coffee beans

作為世界三大饮料之一的咖啡，因兼具消食去腻、提神醒脑、促进消化和独特的保健功能等作用而深受人们的青睐[1]。随着人们生活水平的提高和咖啡受众范围的扩大，咖啡的质量安全问题也受到了日趋广泛的关注。影响咖啡质量安全的因素主要有空气土壤、农药化肥、虫害、流通加工等[2]，其中农药残留是人们最为关注的因素之一。硫丹（Endosulfan，ES），于1956年由赫司特公司开发[3]，化学名称为1，2，3，4，7，7-六氯双环[2，2，1]庚烯-（2）-双羟甲基-5，6-亚硫酸酯，包括α-硫丹和β-硫丹，其代谢物主要为硫丹硫酸酯，该物质不易降解且容易转移至环境中，属于持久性有机污染物[4]。硫丹是一种高效广谱的高毒有机氯杀虫剂（Organo Chlorine Pesticides，OCPs）[5]，具有杀虫速度快、持效期长、对天敌和益虫友好等特点[6]，目前主要在咖啡、烟草和棉花等作物上施用。常规生产中多采用化学防治——喷施农药的手段进行病虫害防治，从而致使咖啡中存在农药残留的可能[7]。研究结果表明，杀虫剂硫丹是一种稳定的有机氯化合物，进入环境后降解周期长，毒性大，具有较高的持久性[8-12]，同时在水生和陆生生态系统中具有生物累计性[13-15]。由于高毒、生物蓄积性、环境污染的持久性和远距离环境迁移能力，其对生态环境的影响和对人类生命健康的危害日益引起世界各地区的广泛关注，《斯德哥尔摩公约》明确规定：禁止在全球范围制造和使用硫丹及其代谢物农药[16]。因此为防止硫丹及其代谢物在生物及环境中的残留对人类带来的危害，建立其检测方法具有重要意义。本文主要采用气相色谱检测生咖啡豆中硫丹及其代谢物残留，通过系列方法验证手段验证所建立方法对生咖啡豆基质检测的可行性，以期为生咖啡豆中硫丹及其代谢物测定提供准确的定量方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯：天津阿尔塔科技有限公司；正己烷、丙酮（色谱纯）：JT. Baker；乙腈（分析纯）：西陇科学；硫酸镁、氯化钠：天津风船化学试剂有限公司；EMR-Lipd除脂分散净化管：安捷伦科技有限公司；弗罗里硅小柱：博纳艾杰尔科技有限公司。

生咖啡豆，市售有机咖啡，购于爱伲庄园，品种为卡蒂姆。

1.2 仪器与设备

色谱柱（HP-5ms，柱长30 m，内径0.25 mm，膜厚0.25 μm）：安捷伦科技有限公司；气相色谱仪（GC-2010Pius，配电子捕获检测器）：日本岛津有限公司；分析天平（BT25S）：Sartorius股份公司；涡旋混合器（IKA-MS3）：德国IKA有限公司；旋转蒸发仪（R-215）：布奇实验室设备有限公司；离心机（3015）：德国Sigma公司；氮吹仪：美国Organomation。

1.3 试验方法

1.3.1 标准工作液的配制

分别准确移取浓度为100 μg·mL-1 α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯1 mL至10 mL比色管中，以正己烷溶解并定容至10 mL配制浓度为10 μg·mL-1的混合标准储备液；移取0.25 mL混合标准储备液，用正己烷溶解并定容至5 mL配制浓度为0.5 μg·mL-1的标准中间液。分别吸取标准使用液20 μL、40 μL、100 μL、200 μL、400 μL、1 000 μL于已净化的咖啡生豆基质中用正己烷定容至1 mL，涡旋混匀，基质标准工作液系列浓度为0.01 μg·mL-1、0.02 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1和0.50 μg·mL-1。

1.3.2 仪器条件

检测器：电子捕获检测器；载气：高纯氮气，恒压模式；进样口温度：250 ℃；检测器温度：320 ℃；进样体积：1 μL，不分流；电流保持：1.0 nA。程序升温：150 ℃保持2 min，以80 ℃·min-1升至210 ℃，以5 ℃·min-1升至250 ℃保持15 min，再以10 ℃·min-1升至300 ℃，保持20 min。

1.3.3 样品制备

生咖啡豆样品经粉碎机粉碎，过0.25 mm筛，筛网上的继续粉碎，直至所有的样品都已过筛，制备均匀的样品。

1.3.4 样品处理

（1）提取。准确称取5 g试样于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋混匀，放置过夜，振摇30 min，4 200 r·min-1离心5 min。准确从离心管中吸取7 mL上清液于15 mL EMR-Lipd除脂分散净化管中，加入3 mL水，涡旋混匀，4 200 r·min-1离心5 min。将上清液转移至15 mL离心管中，加入1.6 g硫酸镁和0.4 g氯化钠，涡旋混匀，4 200 r·min-1离心5 min，吸取5 mL上清液至10 mL试管中，在水浴条件下氮吹净干，2 mL正己烷溶解待测定。

（2）净化。将弗罗里硅小柱放在固定架上，依次用5 mL丙酮+正己烷（10+90）、5 mL正己烷预淋洗小柱。当溶剂液面达柱吸附层表面时，立即倒入净化液，用试管接收洗脱液，用2 mL正己烷冲洗试管后淋洗弗罗里硅小柱，并重复一次。再加入10 mL丙酮+正己烷（10+90）淋洗弗罗里硅小柱，将淋洗液置于氮吹仪上浓缩至近干，用1.00 mL正己烷定容，装入样品瓶中采用气相色谱检测。

1.3.5 样品测定

取经1.3.4处理的样品溶液，采用1.3.2仪器条件测定，通过保留时间定性，外标法定量。

2 结果与分析

2.1 前处理方法优化

2.1.1 净化方法的优化

生咖啡豆较其他基质样品含有较高的植物油脂，实验分别采用艾杰尔C18固相萃取柱、QuEChERS除脂净化包净化提取液，最终浓缩净干时发现试管底部仍残留大量油脂，检测时干扰较强、回收率偏低，且对设备造成一定程度的污染。前处理中为有效去除油脂，本实验采取增强型除脂净化包结合弗罗里硅小柱除去提取液中的植物性油脂，实验证明其除脂效果较为理想，待测液清亮透明，且目标分析物回收率均大于80%。

2.1.2 基质效应及基质标线的选择

标准曲线作为定量分析中的参照，其准确与否直接影响定量结果的准确性，标准曲线的准确包括浓度的准确和方法的匹配性，其中标准溶液与方法的匹配性主要由基质及前处理造成，目前主要通过基质因子（Matrax Factor，MF）评价，基质因子的计算公式为基质因子（MF）=基质目标物存在时的峰响应/基质目标物不存在时的峰响应。通过实验计算目标分析物在0.5 mg·L-1浓度下的基质因子，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的基质因子分别为2.4、3.4和3.6，在该方法中均表现为基质增强，为补偿基质效应确保定量的准确性，实验采用基质标准曲线定量，即将空白基质样品净化浓缩后作为背景配制标准曲线。

2.2 色谱图

在1.3.2仪器条件下，3种农药的空白基质气相色谱图和基质标准品色谱图见图1。由图可见，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯在色譜图上的分离较好，分离度均大于1.5，满足色谱定量分析的要求。

2.3 线性方程与检出限

在1.3.2仪器工作条件下对3种农药标准曲线进行测定，以峰面积A对浓度C作图，绘制标准工作曲线。在生咖啡空白基质中分别加入0.1 mg·kg-1的硫丹及其代谢物，按1.3.4方法净化处理后测定，以3倍信噪比计算为该方法的检出限。3种农药的线性范围、线性方程、相关系数和检出限见表1。

由表1可知，3种农药在0.01～0.50 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.995，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的检出限分别为0.004 4 mg·kg-1、0.004 2 mg·kg-1、0.002 2 mg·kg-1，测定下限为0.01～0.02 mg·kg-1。

2.4 正确度与精密度

在生咖啡空白基质中分别加入0.02 mg·kg-1、0.05 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1 3种农药，静置30 min后提取净化并测定，每个水平加标分别做6个平行，计算回收率和精密度，结果见表2。

通过表2可以看出，在咖啡生豆基质中，3种农药加标回收率为80.1%～94.1%，相对标准偏差为2.4%～9.1%，满足《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）中准确度和精密度的要求，该方法可以用于测定生咖啡豆中硫丹及其代谢物。

3 结论

本文选取乙腈作为提取试剂、15 mL EMR-Lipd除脂分散净化管作为除脂试剂建立了一种气相色谱检测咖啡豆中有机氯农药残留的方法，数据表明该方法提取、除脂效果好，分离度高，适用于脂肪含量高的物质。该法操作简单，准确度、灵敏度高，可以作为实验室同时检测咖啡豆中硫丹及其代谢物的方法。

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