一起由金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌引起食物中毒的实验室检测分析

王宇 国霞 王伟

摘 要：目的：通过实验室微生物检测查清山东省淄博市淄川区一起学校食物中毒事件的原因，为相似的食源性疾病暴发事件提供处置依据。方法：采集可疑食品及其包装袋8份、病例呕吐物2份至实验室进行常见致病菌检测，用实时荧光PCR方法测定增菌液中的金黄色葡萄球菌肠毒素类型。结果：1份面包屑检出金黄色葡萄球菌，1份吃剩的鸡腿檢出蜡样芽胞杆菌，其余样品未检出可疑致病菌。结论：根据采集样品实验室微生物检测结果，结合现场流行病学调查以及中毒病例临床症状综合分析，此事件因食物保存不当，导致金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌滋生，食入引起食物中毒。

关键词：食物中毒；金黄色葡萄球菌；蜡样芽胞杆菌；实验室检测

Abstract： Objective： To investigate the cause of a school food poisoning event in Zichuan District through laboratory microbiological testing， and provide a basis for handling similar foodborne disease outbreaks. Method： 8 samples of suspicious food and its packaging bags and 2 samples of case vomitus were collected to the laboratory for common pathogenic bacteria detection， and the the type of Staphylococcus aureus in the enrichment solution was detected by real-time fluorescent PCR for enterotoxin detection. Result： Staphylococcus aureus was detected in 1 bread crumb， Bacillus cereus was detected in 1 leftover chicken leg， and no suspicious pathogenic bacteria were detected in the remaining samples. Conclusion： According to the microbial laboratory test results of collected samples， combined with  on-site epidemiological investigation and comprehensive analysis of clinical symptom of poisoning cases， this school food poisoning event was caused by eating food that was bred by Staphylococcus aureus and Bacillus cereus.

Keywords： food poisoning; Staphylococcus aureus; Bacillus cereus; laboratory testing

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种重要的食源性致病菌且在自然界中广泛存在[1]。研究表明，每年的细菌性食物中毒事件中，由金黄色葡萄球菌及其毒素引起的食物中毒事件约占25%，已经成为我国引发细菌性食物中毒的主要致病因子之一[2]。蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）是一种条件致病杆菌，易污染该菌的食物有米制品、乳类、熟肉、蔬菜及汤类等。被污染的食品外观一般无异常且无异味，容易被忽略，该菌可产生肠毒素，通常食用含菌量大于105 CFU·mL-1（CFU·g-1）的食品即可引起人呕吐型或腹泻型食物中毒[3]。

1 材料与方法

1.1 样本来源

患者呕吐物2份（编号1#、2#）；面包包装袋样本2份、面包屑1份、吃剩鸡腿样本1份、鸡腿包装袋2份、柠檬水1份和可乐鸡米饭1份，依次编号为3#～10#，以上采集样品均放置在无菌采样袋中。

1.2 仪器与试剂

GSP-9050隔水式培养箱、JSH-250生化培养箱、生物显微镜、生物安全柜、Baird-Parker（B-P）琼脂平板、沙门菌属显色培养基、甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP），均由青岛海博生物科技公司提供；营养琼脂均由北京陆桥公司提供；GP生化鉴定卡；磷酸盐缓冲液（PBS）；A、B、C、D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素实时荧光PCR检测试剂盒；Q5型荧光定量扩增仪。

1.3 方法

1.3.1 检验方法

参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10—2016）[5]对金黄色葡萄球菌进行检验；参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》

（GB /T 4789.14—2014）[6]对蜡样芽胞杆菌进行检验；参照《食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）[7]对沙门氏菌进行检验。

1.3.2 细菌培养

①将1#～10#样本前处理后无菌操作分别接种到7.5%氯化钠肉汤等相应的增菌液中增菌，后接种到对应的选择培养基（36±1）℃在培养箱培养24 h，观察结果。②处理好的样品匀液涂布于MYP平板，置培养箱（30±1）℃培养24 h，观察菌落生长情况。增菌后的培养物接种到金黄色葡萄球菌B-P选择平板、沙门氏菌显色平板，于（36±1）℃培养24 h，观察结果。

1.3.3 涂片镜检

挑取适量可疑典型菌落涂片后固定，用革兰氏染色法染色后镜检。

1.3.4 生化实验

挑取纯培养的菌落分别进行相应的生化实验验证细菌种类。

1.3.5 PCR检测

5#样本检出的金黄色葡萄球菌用PCR方法测定肠毒素，取适量单个菌落金黄色葡萄球菌至离心管（生理盐水1 mL）中研磨，置离心机离心5 min（转速12 000 r·min-1），倒掉上清液，留取沉淀；加入DNA提取液50 μL，用加样枪混匀沉淀使其悬浮，100 ℃温浴5 min，置离心机离心5 min（转速

12 000 r·min-1），留上清液待测，使用Q5荧光定量扩增仪，根据试剂盒说明书设定PCR反应条件，FAM通道采集荧光信号。

2 结果与分析

2.1 流行病学调查情况

2021年6月4日，淄川区疾病预防控制中心接到某医院急诊科报告疑似食物中毒患者2名，根据《食品安全事故流行病学调查技术指南（2012年版）》[4]赶赴现场展开流行病学处置工作，两人为某校学生，于当日中午在学校宿舍共同进食芒果、网购包装鸡腿、网购面包、柠檬水和可乐鸡米饭，均有头晕、恶心、呕吐、腹痛和精神不佳等症状；呕吐约为3次/h，1例伴发热，体温37.6 ℃，平均潜伏期为3.6 h。

2.2 增菌培养与分离结果分析

培养的增菌液和分离的选择平板基上可见5#、6#有可疑菌落生长，其他样本所检项目未检出。5#在Baird-Parker显色平板上呈圆形、表面光滑、湿润，直径2～3 mm的粉红色菌落，见图1，涂片染色后镜检可见革兰氏阳性的蓝色球菌，呈葡萄串状，血浆凝固酶试验阳性，检测结果是金黄色葡萄球菌；6#在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂上培养后长出微粉色典型菌落，菌落周围有沉淀环，见图2，涂片染色显微镜下见蓝色革兰氏阳性的杆菌，菌体中央有芽孢，为椭圆形，不膨出于菌体，呈链状排列，通过相应的生化实验结果鉴定为蜡样芽胞杆菌，见表1。5#通过PCR检测肠毒素类型为A型，见表2。

3 结论与讨论

根据现场流行病学调查情况、中毒病例临床症状判断、实验室微生物检测结果综合分析，证实本起事件为细菌性食物中毒，致病菌为金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌，是因网购食品储藏不当所造成的。金黄色葡萄球菌的最适生长繁殖温度为30～37 ℃。

如果食品加工的任何环节被金黄色葡萄球菌污染，在合适的温度下，金黄色葡萄球菌会在短时间内大量繁殖并产生肠毒素，通过被污染的食物进入人体引起严重的食物中毒[8]。在常见的食源性致病菌中，蜡样芽胞杆菌也是其中之一，该菌引起的食物中毒事件时有发生，严重危害人们的健康[9]。此事件发生在夏季，正值高温季节，两名学生患者食用开封后未冷藏保存的网购面包和鸡腿，因细菌滋生导致食物中毒。建议卫生部门针对社区、学校、企业、养老院和托幼机构等重点场所加强食品健康知识宣传，提高预防食源性疾病的意识；监管部门加强对食品生产和流通行业的督导力度，及时发现安全隐患，从源头上减少食源性疾病的

發生。

本文着重从实验室检测方面分析，采集的10份样品中，仅在5#和6#食物样本中检测到致病菌，而中毒病例的呕吐物中未检测出可疑的致病菌。多年来，在我国的食源性疾病暴发事件中，致病原因不明的急性胃肠炎占20%左右[10-11]，临床症状的相似性导致事件的溯源难度变大，实验室检测尤为重要，实验室检验水平与食源性疾病病因查明密切相关，在开展食物中毒流行病学调查处置时，要注意样品采集和实验室检测的重要性，不断提高检验能力。本次事件的实验室检测多采用传统检验技术，但金黄色葡萄球菌肠毒素类型检测运用了PCR技术，这也说明基层疾控机构在检验技术方面有了一定发展。随着分子生物学的发展，病原溯源已进入生物信息学时代，通过基因型、分子型或全基因组测序等方法获得更准确的结果，对食源性病原体进行鉴定和事件溯源[12]，这就需要不断学习更新专业技术水平，增强基层实验室的标准化建设，提高食源性疾病致病因子的检出水平，为食源性疾病的溯源提供更精准的技术支撑。

参考文献

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[3]张志强，陈雅丽，刘红丽，等.2018—2021年陕西省汉中市食品蜡样芽孢杆菌污染状况研究[J].医学动物防制，2023，39（4）：348-351.

[4]佚名.卫生部办公厅关于印发《食品安全事故流行病学调查技术指南（2012年版）》的通知[J].中华人民共和国卫生部公报，2012（6）：23.

[5]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验：GB 4789.10—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[6]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验：GB 4789.4—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[7]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验：GB 4789.14—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.

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[9]杨艳华，吕鹏，陈克平.蜡样芽孢杆菌主要毒素及检测方法的研究进展[J].生命科学研究，2021，25（6）：471-478.

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[12]龙冬玲，张慧娟，萧松建，等.一起由蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒实验室检测及分子溯源[J].河南预防医学杂志，2021，32（12）：901-905.