金莲花黄酮类成分抗菌及抗氧化活性研究

刘艺苑,刘传敏,李新朋,康悦,陈虞超,郭生虎,李艳蕊,张锦添,刘姝,薛涛*,张波*

(1.临沂大学医学院,山东 临沂 276005;2.江苏省农业科学院兽医研究所,江苏 南京 210014;3.宁夏农林科学院农业生物技术研究中心,宁夏 银川 750002)

金莲花为毛茛科植物金莲花(TrolliuschinensisBge.)的干燥花,广泛分布于西南、西北、华北、东北地区。该药始见于《本草纲目拾遗》[1]且被《中国药典》1977年版(一部)收录[2]。现代药理研究表明,金莲花具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用,临床上主要用于治疗感冒、发烧、慢性扁桃体炎、急性鼓膜炎、尿路感染等炎症[3]。

金莲花主要含黄酮类、酚酸类和生物碱类成分,其中金莲花含黄酮类成分含量丰富,约为10%～20%,黄酮苷类结构是金莲花黄酮类成分的主要结构类型,少数为黄酮醇、二氢黄酮和黄酮氧糖苷类结构[4-6]。目前已从金莲花中鉴定出黄酮类成分约99种,主要包括荭草苷、牡荆苷、金丝桃苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、鼠尾草素等[7]。其中荭草苷占总黄酮比例约10%,而牡荆苷占总黄酮比例约2%,是目前金莲花中研究最广泛的两种黄酮类成分[8]。

抗菌及抗氧化活性是评价清热解毒类中药质量的重要活性指标,也是发掘清热解毒类中药活性物质基础的重要途径,因此本项研究以金莲花黄酮类成分(总黄酮、荭草苷、牡荆苷)为研究对象,通过体外抑菌活性试验探索金莲花抗菌活性及其物质基础,并通过黄酮类成分的抗氧化活性初步研究其抗菌机制,该研究可为基于金莲花的新药开发提供参考。

1 材料和仪器

1.1 材料及试剂 金莲花由宁夏农林科学院提供,经郭生虎教授鉴定为毛茛科植物金莲花(TrolliuschinensisBge.)的干燥花;芦丁(CAS:153-18-4,纯度:98%)、荭草苷(CAS:28608-75-5,纯度:98%)、牡荆苷(CAS:3681-93-4,纯度:98%)标准品购自成都埃法生物科技有限公司;菌株大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、变异链球菌、链霉菌、红酵母、黑曲霉、白色念珠菌等来自本实验室保存。

硝酸铝、邻苯三酚、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、水杨酸、FeSO4·7H2O、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)等均购自上海麦克林生化科技有限公司;麦氏比浊管,购自常德比克曼生物科技有限公司。

1.2 仪器 旋转蒸发仪(德国IKA公司);无菌超净台(苏州安泰空气技术有限公司);SILFTA型荧光酶标仪(美国BioTek公司);UV-5500紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司);FA1204N型电子分析天平(上海菁海仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 金莲花总黄酮的提取及其含量的测定

2.1.1 金莲花中总黄酮的提取 准确称取600 g经预处理的金莲花,按照料液比1∶10,加入60%的乙醇,于90 ℃下回流提取两次,每次1.5 h,趁热过滤,合并滤液。用旋转蒸发仪浓缩液体,温度为65 ℃,然后乙醇沉淀,静置过夜,除去沉淀部位,取上清液,再次浓缩,冷冻干燥后即得金莲花总黄酮。

2.1.2 标准曲线的建立 分别精确移取100 μg·mL-1的芦丁标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于7个20 mL比色管中,并进行编号0～7。每个比色管中补加60%乙醇溶液至1 mL。在每个比色管中加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液,摇匀,放置6 min。再加入1 mL 10%的硝酸铝溶液,摇匀混合液,放置6 min,加入1 mol·L-1的氢氧化钠溶液10 mL,加水至终体积20 mL,摇匀显色,放置15 min。以0号试管为空白,光程1 cm,使用紫外分光光度计,测定510 nm处的吸光度。以吸光度(A)为纵坐标,芦丁质量浓度(μg·mL-1)为纵坐标,采用线性回归法计算出标准曲线的回归方程。

2.1.3 金莲花总黄酮含量的测定 取30 mg样品,用50 mL 60%的乙醇溶解,过滤。按“2.1.2”项下的方法处理后在510 nm处测定吸光度,并计算出其含量。

2.2 体外抑菌试验

2.2.1 培养基的配制 将M-H琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)等灭菌后进行浇板,每个培养皿内浇注25 mL约4 mm厚的培养基,待培养基凝固后备用。

2.2.2 菌浓度的确定 按0.5号麦氏比浊管的操作方法,将9种待测的试验菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、变异链球菌、链霉菌、红酵母、黑曲霉、白色念珠菌的菌浓度调整到3×108CFU·mL-1备用。

2.2.3 管碟法进行抑菌试验 确定各待测样品浓度为30 mg·mL-1。称取一定量的金莲花总黄酮、荭草苷、牡荆苷,用10%的二甲基亚砜(DMSO)溶解,同时细菌设1.25 mg·mL-1阿莫西林作阳性对照,真菌设2.5 mg·mL-1的伊曲康唑做阳性对照,10%的DMSO作为阴性对照。

将确定好浓度的各试验菌液200 μL移入凝固好的平板中,使用涂布棒涂布均匀。用镊子夹取牛津小杯置于含菌平板上,加入待测样品。37 ℃培养24～48 h,每个样品重复3次。同时设立阳性和阴性对照。结果判断用游标卡尺精确量取,根据抑菌圈的直径大小判断该菌对药物的敏感程度。

2.3 MIC和MBC的测定

2.3.1 混悬液的制备 经纯化鉴定后,将试验菌接种在液体培养基中,摇菌至对数生长期后,按照0.5号麦氏比浊管操作方法,将菌液浓度稀释后调整到1.5×106CFU·mL-1,备用。吸取1 mL上述菌液加入1 mL培养液中,充分混匀后,即得到混悬液。

2.3.2 MIC及MBC的测定 首先,将金莲花总黄酮、荭草苷、牡荆苷3种待测样品分别溶解于10% DMSO溶液中。将各待测样品进行倍比稀释。分别取稀释后的各梯度样品100 μL逐个加入96孔平板中;然后再各孔中加入100 μL混悬液,充分混匀(菌液终浓度为3.75× 105CFU·mL-1),每个浓度设置3个平行样品,同时设立阳性和阴性对照。此时各孔中金莲花总黄酮和荭草苷的浓度梯度分别为:2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 mg·mL-1;牧荆苷的浓度梯度分别为:25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg·mL-1。调整后恒温37 ℃培养24 h后,取出96孔板,并对各个孔进行逐个检查,用肉眼观察其浑浊程度。如果某孔的培养液出现膜状物或浑浊为“+”;无膜状物且澄清透明为“-”。从96孔板上取MIC以上各孔100 μL,分别涂布在固体培养基上,在相同条件下培养24 h。培养平皿中无菌生长的样品最小浓度定义为该样品的MBC。

2.4 抗氧化能力的测定

2.4.1 羟自由基清除能力的测定 采用水杨酸法[9]测定金莲花总黄酮、荭草苷和牡荆苷3种成分的羟基自由基清除能力。在10 mL比色管中依次加入1 mL 6 mmol·L-1FeSO4,1 mL样品溶液,1 mL 6 mmol·L-1H2O2,混匀后室温放置10 min,最后加入6 mmol·L-1乙醇-水杨酸,摇匀,37 ℃水浴加热15 min后取出,于510 nm处测其吸光值。并依据式(1)进行计算。

羟自由基清除率=[1-(As-As0)/A0]×100%

(1)

其中A0为空白对照吸光值,反应体系中以蒸馏水代替被测样品;As为样品吸光值;As0为样品本底吸光值,反应体系中以蒸馏水代替H2O2。

2.4.2 超氧阴离子自由基清除能力的测定 采用邻苯三酚法[10]测定金莲花总黄酮、荭草苷和牡荆苷3种成分的超氧阴离子自由基清除能力。分别向10 mL离心管中分别依次加入0.1 mol·L-1Tris-HCl溶液4.5 mL,蒸馏水2.4 mL,不同浓度的样品溶液1 mL,混匀,室温反应10 min后加入0.1 mL 10 mmol·L-1HCl终止反应,于325 nm处检测吸光值。并依据式(2)进行计算。

超氧阴离子清除率=[1-(As-As0)/A0]×100%

(2)

其中A0为空白对照吸光值,反应体系中以蒸馏水代替被测样品;As为样品吸光值;As0为样品本底吸光值,反应体系中以蒸馏水代替邻苯三酚。

2.4.3 DPPH自由基清除能力的测定 向10 mL比色管中分别加入2 mL样品,然后加入2 mL 0.1 mmol·L-1DPPH乙醇溶液,混匀后室温避光反应30 min,517 nm测定吸光值。无水乙醇调零。并依据式(3)进行计算。

DPPH清除率=[1-(As-As0)/A0]×100%

(3)

其中A0为空白对照吸光值,反应体系中以无水乙醇代替被测样品;As为样品吸光值;As0为样品本底吸光值,反应体系中以无水乙醇代替DPPH。

3 实验结果

3.1 金莲花总黄酮含量的测定 以芦丁质量浓度为横坐标(X),吸光度为纵坐标(Y),标准曲线方程为Y=0.000 6X-0.000 3,R2=0.999 3,结果表明在10～60 μg·mL-1范围呈现比较好的线性关系。经计算样品中总黄酮的浓度为32.18 μg·mL-1,含量为64.3%。

3.2 体外抑菌试验结果 试验结果表明,在30 mg·mL-1的作用浓度下,金黄色葡萄球菌对金莲花总黄酮、荭草苷中度敏感,对牡荆苷低度敏感(见表1);变异链球菌对荭草苷中度敏感,对金莲花总黄酮、牡荆苷低度敏感(见表2)。其他待测菌如伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、链霉菌以及红酵母、黑曲霉、白色念珠菌对金莲花总黄酮、荭草苷、牡荆苷均不敏感。

表1 待测样品对金黄色葡萄球菌的体外抑菌试验结果

表2 待测样品对变异链球菌的体外抑菌试验结果

3.3 MIC和MBC的测定结果 金莲花总黄酮、荭草苷和牡荆苷对变异链球菌MIC值分别为0.312 5、0.156 25、3.125 mg·mL-1。金莲花总黄酮、荭草苷、牡荆苷对金黄色葡萄球菌MIC值分别为0.156 25、0.156 25、6.25 mg·mL-1。金莲花总黄酮、荭草苷和牡荆苷对变异链球菌MBC值分别为1.25、0.625、12.5 mg·mL-1。金莲花总黄酮、荭草苷、牡荆苷对金黄色葡萄球菌MBC值分别为0.625、0.625、25 mg·mL-1。结果表明,金莲花总黄酮对变异链球菌和金黄色葡萄球菌表现出较强的抑菌和杀菌效力,其主要成分荭草苷比牡荆苷表现出更强的抑菌和杀菌效力。

3.4 抗氧化能力测定结果 金莲花总黄酮、荭草苷、牡荆苷对超氧阴离子、DPPH和羟基自由基的清除效果见表3。

由表3可知,金莲花总黄酮、荭草苷和牡荆苷对3种自由基均表现出较好的清除能力,其中对超氧阴离子的清除能力,牡荆苷>荭草苷>总黄酮;对羟基自由基和DPPH的清除能力,总黄酮>荭草苷>牡荆苷。从总体来看,其主要成分荭草苷的抗氧化活性优于牡荆苷。

表3 金莲花总黄酮、荭草苷、牡荆苷抗氧化活性结果

4 讨论

金莲花颗粒、金莲花胶囊等为临床常用清热解毒类中成药,但其君药金莲花的药效物质基础尚不明确。黄酮类成分是目前金莲花研究最为广泛且含量相对较高的一类成分,本实验结果表明,金莲花总黄酮、荭草苷、牡荆苷对细菌的抑制作用要优于真菌;对革兰阳性细菌的抑制作用优于革兰阴性细菌。可能与黄酮类物质本身所具有的酚羟基的结构有关,使其具有酚类的通性,具有类似苯酚的抑菌作用;同时黄酮类物质可以使溶液呈弱酸性,也不利于细菌的生长。

金莲花主要抑菌对象是革兰阳性细菌,因此推测金莲花主要有效抑菌成分的作用部位可能在于细菌的细胞壁上。本实验中,荭草苷对革兰阳性细菌变异链球菌和金黄色葡萄球菌均表现出较强的杀伤效力,杀菌效果明显优于金莲花总黄酮和牡荆苷。

抗氧化实验研究发现,金莲花总黄酮、荭草苷和牡荆苷对3种自由基均表现出一定的清除能力,但荭草苷抗氧化活性整体上优于牡荆苷,与其抗菌效果一致,说明抗氧化可能是其潜在抗菌机制之一。本研究亦证实金莲花黄酮类主要成分荭草苷是金莲花清热解毒活性的有效成分之一。