许氏平鮋源嗜水气单胞菌分离鉴定与药敏试验

李惠

摘要：为了解青岛地区人工养殖许氏平鮋（Sebastes schlegelii）病原菌嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的流行情况和耐药性情况。对2020～2021年采集青岛地区人工养殖场中病死许氏平鮋的肝脏、肠道等病料组织127份，采用常规的细菌分离鉴定方法和PCR方法进行嗜水气单胞菌分离鉴定，采用人工感染动物试验和K-B药敏纸片法分别检测嗜水气单胞菌分离菌株的致病性和耐药性。结果显示：从127份病料样品中分离到68株嗜水气单胞菌，分离率为53.5%（68/127），50株嗜水气单胞菌可以引起许氏平鮋死亡为致病性菌株；50株许氏平鮋对新霉素、氟苯尼考、大观霉素等9种药物耐药率在52.0%以上，对其他的药物耐药率为4.0%～30%。该研究为许氏平鮋源嗜水气单胞菌合理用药及防控提供了参考。

关键词：许氏平鮋（Sebastes schlegelii）；嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）；分离鉴定；致病性；药敏试验

中图分类号：Q93；S965.399文献标志码：A

许氏平鮋（Sebastes schlegelii）又称为黑鱼、黑头和黑鲪等，属鮋形目（Scorpaeniformes）、鮋科（Sebastidae）、平鮋属（Sebastes），主要分布于中国的渤海、黄海及东海地域，主要以网箱养殖模式进行饲养^[1]。许氏平鮋属于冷水性肉食性鱼类，富含多种营养物质且肉质鲜美、生长速度较快、抗病能力强，在中国北方沿海人工养殖广泛且成为主要冷水性鱼类养殖品种^[2-3]。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila ，以下简称A.hydrophila）为临床中常见的人-畜-水生动物共患的病原菌之一，该菌广泛存在于自然界中土壤、水源及养殖环境中，且对大多数的哺乳动物、水生动物及人具有不同的致病性^[4]。A.hydrophila可以引起多种动物和人的败血症、肺炎、腹泻、化脓及毒素引起的休克等一系列的临床症状，同时可以引起食物中毒，严重危害着动物和人的健康，对该病的防控具有重要的意义^[5]。A.hydrophila可以感染多种动物及野生动物（猪、牛、羊、鹿），尤其对鱼类（多宝鱼、半滑舌鳎鱼、大黄鱼、黄颡鱼等）致病性较强，其感染率和死亡率均较高，成为鱼类养殖过程中的常见的病原菌之一，严重危害鱼养殖业的发展^[5-6]。近年来，关于A.hydrophila感染鱼类的报道越来越多，临床中以体表磷脱落出血、肛门脱垂及肠炎等症状为多见，其死亡率较高，给养鱼业造成严重的经济损失^[7]。国内外相关研究表明，A.hydrophila耐药性已经普遍存在且呈现逐年增高的趋势，给临床用药带来一定困难，已成为公共卫生安全问题^[8]。该试验对采集病死许氏平鮋的肝脏、肠道等病料组织127份进行嗜水气单胞菌分离鉴定，并检测其致病性和耐药性，以期为该地区许氏平鮋源嗜水气单胞菌合理用药提供了参考。

1  材料与方法

1.1 菌株来源

2020～2021年采集青岛地区人工养殖场中病死许氏平鮋的肝脏、肠道等病料组织127份，对采集的样品进行处理并进行嗜水气单胞菌的分离鉴定。

1.2 细菌分离与培养

将采集的样品进行处理后，无菌的条件下接种于7%绵羊脱纤血液培养基进行增菌培养，30℃恒温培养12hrs～18hrs后，挑取单个菌落接种于AHM選择培养基上进行鉴别培养，37℃培养12hrs～18hrs，进行革兰氏染色镜检观察其形态学。

1.3 生化试验鉴定

参照VITEK2革兰氏阴性细菌鉴定卡说明书，将分离菌株接种在营养肉汤中培养至对数期，调整菌液浓度为0.5个麦氏浊度，无菌的条件接种于纸质条中， 37℃培养12hrs～18hrs进行生化特性鉴定。

1.4 细菌PCR鉴定

根据参考文献^[9]设计细菌16SrRNA 基因通用引物，在上海生共合成引物（表1）。用水煮沸提取分离菌株的基因组并进行PCR鉴定。回收PCR产物回收送上海生共测序与比对。

1.5 致病性试验

参考文献^[7]的方法，将分离菌株接种于营养肉汤中培养至对数期调整菌液浓度为10⁷cfu/mL，每株分离菌株肌肉注射5尾500g左右许氏平鮋，剂量为0.25mL（10⁷cfu/mL），对照组给予等量的无菌生理盐水。试验期为7d并观察许氏平鮋发病情况。

1.6 药敏试验

分离菌株的药敏试验参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2013年推荐的药敏试验法标准进行操作与结果判定。

2 结果

2.1 细菌分离培养

疑似A.hydrophila的菌株通过7%绵羊脱纤血液培养基、AHM选择培养基上进行鉴别培养分离培养及镜检观察其形态学结果，均符合A.hydrophila的培养特性和形态学。

2.2 细菌生化试验

通过VITEK2革兰氏阴性细菌鉴定卡进行生化鉴定，68株分离菌株初步鉴定为A.hydrophila。

2.3 细菌PCR鉴定

对初步鉴定为A.hydrophila用PCR进行进一步鉴定。结果显示分离的68株分离菌株均扩增出大约为1500 bp的目条带（图1）。通过测序对比68株分离菌株与参考株（A.hydrophila）的同源性均大于98%，说明分离株为A.hydrophila，分离率为53.5%（68/127）。

2.4 致病性试验

攻毒组许氏平鮋在攻毒后2d～3d出现了不同的发病情况，且个别攻毒的许氏平鮋不表现任何症状出现急性死亡，剖检死亡的许氏平鮋后采集病料组织，分离得到A.hydrophila，攻毒试验结束对照组许氏平鮋健康存活。经统计，50株A.hydrophila能引起许氏平鮋死亡为致病性菌株。

2.5 药敏试验

分离菌株的耐性分析显示，50株致病性A.hydrophila对新霉素、氟苯尼考、大观霉素、氨苄西林、庆大霉素、磺胺间甲氧嘧啶、青霉素、阿莫西林、氨苄西林、多西环素等9种药物的耐药率为52.0%～84.0%之间，对头孢噻呋、头孢噻肟、恩诺沙星、环丙沙星、林可霉素5种药物耐药率为4.0%～30%；说明临床中分离的50株致病性A.hydrophila对临床中常用的药物具有不同的耐药性。

3 讨论

A.hydrophila为临床中常见的人-畜-水生动物共患的条件性致病菌，该菌广泛存在于环境中及水环境中，该菌可以通过多种途径（直接接触传播、空气传播、黏膜创伤、消化系统感染）在不同水生动物之间传播^[10]。A.hydrophila可以引起多种动物及野生动物感染，急性病例具有发病比较急、死亡率较迅速等特定，为鱼类常见的急性、败血性的一类疾病^[4-5]。近年来，关于鱼类A.hydrophila的报道越来越多，尤其对人工养殖的鱼类危害较大。该试验从采集青岛地区人工养殖场中病死许氏平鮋的肝脏、肠道等病料组织127份分离到50株致病性A.hydrophila，说明A.hydrophila在许氏平鮋养殖中流行严重，可能对许氏平鮋存在潜在危害性，应该引起重视。

临床中A.hydrophila病主要通过抗菌药物进行防治，随着抗菌药物的不合理使用，对青霉素、头孢菌素类、氨基糖苷类等药物产生较强的耐药性，其耐药性菌株不断出现，同一地区不同养殖场的耐药性也存在差异性，降低了治疗效果^[11]。该研究表明，50株A.hydrophila对新霉素、氟苯尼考、大觀霉素等9种药物耐药率在52.0%以上，对其他的药物耐药率为4.0%～30%。说明从许氏平鮋养殖中分离的A.hydrophila对临床中常用的药物存在不同耐药性，且耐药性严重。因此，在临床中治疗该病应该进行药物试验，选择敏感的药物进行交替使用，同时应该配合环境的消毒，提高治疗效果。

参考文献：

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Isolation and identification of Aeromonas hydrophila  of Sebastes schlegelii origin and drug sensitivity test

LI Hui

（Dalian Ocean Development Affairs Service Center， Dalian 116000， Liaoning China）

Abstract：To understand the prevalence and drug resistance of Aeromonas hydrophila， the pathogenic bacterium of Sebastes schlegelii， in captive culture in Qingdao. The pathogenicity and drug resistance of Aeromonas hydrophila isolates were detected by using the conventional bacterial isolation and identification method and PCR method， and the pathogenicity and drug resistance of Aeromonas hydrophila isolates were detected by the artificial infection animal test and K-B drug-sensitive paper test， respectively. The results showed that the pathogenicity and drug resistance of the isolates were determined by the K-B drug-sensitive paper method. The results showed that 68 strains of Aeromonas hydrophila were isolated from 127 samples， and the isolation rate was 53.5% （68/127）. 50 strains of Aeromonas hydrophila could cause the death of Sebastes schlegelii as pathogenic strains. The resistance rate of 50 strains of Sebastes schlegelii to 9 drugs， including neomycin， florfenicol and spectinomycin， was 52.0% and 4.0%-30% for other drugs. This study provides a reference for the rational drug use and prevention and control of Aeromonas hydrophila of Sebastes schlegelii.

Keywords：redfish （Sebastods schlegelii）; Aeromonas hydrophila; Isolation and identification; Pathogenicity; Drug sensitivity test