基于GC-MS分析不同酿造周期酱油产品的挥发性风味物质

谭戈 肖亮琴 吴昌正 刘翔 萧妍薇 何文彬 侯莎 郭丽琼 林俊芳

摘要：为研究不同酿造周期酱油产品对酱油挥发性风味的影响，文章在对成曲pH和中性蛋白酶酶活力指标测定的基础上，通过气质联用技术对3组不同酿造周期的醬油挥发性风味物质进行鉴定并分析。结果表明，成曲的pH为6.78±0.04，中性蛋白酶酶活力为（2 102.77±60.30） U/g，制曲效果良好；3组酱油样品挥发性风味物质种类较为接近，JY1（90 d）、JY2（180 d）和JY3（270 d）挥发性风味物质种类分别为55，53，50种；3组酱油的挥发性风味物质相对含量随着酿造周期的增加发生了一定转变，尤其是在酿造270 d的酱油样品（JY3），其醇类风味物质明显减少，而酯类和酚类风味物质明显增多；对3组酱油样品挥发性风味物质数据进行主成分分析，聚类分析效果良好。该研究为酱油企业对酿造酱油的生产周期调整及酱油产品的后期调配提供了新的思路和技术方法借鉴。

关键词：气质联用技术；不同酿造周期；酱油；挥发性风味物质；主成分分析

中图分类号：TS264.21      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）04-0161-05

Abstract： To study the effect of soy sauce products with different brewing periods on the volatile flavor of soy sauce， in this paper， based on the determination of indexes of pH and neutral protease activity of finished koji， the volatile flavor compounds of three groups of soy sauce with different brewing periods are identified and analyzed by GC-MS. The results show that the pH of finished koji is 6.78±0.04， the enzyme activity of neutral protease is （2 102.77±60.30） U/g， and the koji-making effect is good; the volatile flavor compound types of the three groups of soy sauce samples are similar， the types of volatile flavor compounds in JY1 （90 d）， JY2 （180 d） and JY3 （270 d） are 55， 53， 50 respectively; the relative content of volatile flavor compounds of the three groups of soy sauce changes to a certain extend with the increase of brewing periods， especially in the soy sauce sample brewed for 270 d （JY3），  the alcoholic flavor compounds of the sample significantly decrease， while the ester and phenolic flavor compounds significantly increase. The data of volatile flavor compounds of the three groups of soy sauce samples are analyzed by principal component analysis， and the results of clustering analysis are good. The research has provided new ideas and technical methods for soy sauce enterprises to adjust the production period of brewed soy sauce and the late deployment of soy sauce products.

Key words： gas chromatography-mass spectrometry； different brewing periods； soy sauce； volatile flavor compounds； principal component analysis

酱油，作为一款传统调味品，历史悠久，深受中国、日本和韩国等亚洲国家消费者的欢迎[1-4]。酱油的生产主要以大豆和小麦为原料，经过微生物菌群及其分泌的酶系作用，再经一系列新陈代谢反应，形成风味独特，色、香、味俱全的调味品[5-9]。酿造酱油呈味机制十分复杂，并不像盐和糖等只有单纯的咸和甜这两种风味，而是微咸而鲜、微甜而醇。优质酱油是以鲜味为主，兼有甜、酸、咸和苦味的调味品[10]。

气质联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）是一种常规的代谢组学研究工具，广泛应用于食品挥发性风味物质的鉴定与分析[11-15]。主成分分析（principal component analysis，PCA）是一种无监督的多元变量统计分析手段，是在多元统计学分析手段中应用广泛的工具[16-19]。PCA可用于对不同加工方式、不同产地、不同发酵周期等的样品进行有效、快速区分[20-23]。

当前，酱油业界关于酱油酿造周期并没有形成统一通用标准，一般的酱油产品酿造周期均在3个月以上。不同酿造周期的酱油，对酱油产品品质和风味有着重要的影响[24]。本文在确保酱油制曲结果较为理想的情况下（以成曲pH和中性蛋白酶活力作为评价指标），通过测定不同酿造周期（90，180，270 d）的酱油原油产品的挥发性风味来分析酿造时间对酱油挥发性风味的影响，为酱油企业对酿造酱油的生产周期方案调整及酱油产品的后期技术调配提供了思路和技术指导。

1 材料和方法

1.1 主要材料

黄豆：购于哈尔滨谷禾商贸有限公司；米曲霉3.042：购于济宁玉园生物科技有限公司；面粉：购于柘城县马培中农产品加工经营部。

1.2 主要试剂

福林酚试剂、L-酪氨酸：北京索莱宝科技有限公司；三氯乙酸：广州齐湘生物科技有限公司；氢氧化钠、盐酸、无水碳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：广州化学试剂厂；酪蛋白：Sigma公司。

1.3 主要仪器和设备

PB-10酸度计 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SPH-2000生化培养箱 广州市深华生物技术有限公司；UV-4802S紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头 美国Supelco公司；TG-Wax MS毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）、TSQ 8000 Evo气质联用仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 酱油酿造工艺

酱油的制曲工艺和发酵工艺参考谭戈等[8]的技术路线，3个试验组发酵周期分别为90 d（JY1）、180 d（JY2）和270 d（JY3）。

1.4.2 成曲pH和中性蛋白酶酶活力的测定

参考Feng等[25]的方法和标准中福林法[26]分别对成曲的pH和中性蛋白酶酶活力指标进行测定。

1.4.3 GC-MS挥发性风味成分的测定

参考谭戈等[8]的挥发性风味程序方法对不同酿造周期的酱油样品的挥发性风味物质进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 成曲pH和中性蛋白酶酶活力测定结果与分析

在整个酱油制曲过程中，由于制曲是在空气自由流通的开放式环境下进行的，部分环境中的“杂菌”得以生长繁殖，如枯草芽孢杆菌、毛霉等。当制曲过程中的发酵时间、温度和通气量等环境条件较适合米曲霉生长时，即米曲霉菌群的生长繁殖等活动在制曲体系中占绝对优势时，成曲的pH通常接近中性（6.8～7.2）[10]。本实验测得成曲的pH为6.78±0.04，说明制曲效果良好，为后期酱油的酿造提供了基础条件。

成曲酶活力的高低影响酱油质量，此外，酱油企业可将酶活力作为评价制曲效果的一个重要参考指标[27-28]。在酱油实际酿造过程中，微生物菌群所分泌的蛋白酶以中性蛋白酶为主，而碱性和酸性蛋白酶较少。这些蛋白酶的催化作用加快了酱油原料中蛋白质的分解，生成甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等呈味氨基酸。这些呈味氨基酸对酱油香气发挥着重要作用，大大丰富了酱油风味物质的种类和含量。本次测得成曲中性蛋白酶酶活力为（2 102.77±60.30） U/g，制曲结果较理想，进一步保证了后期酿造酱油的品质。

2.2  3组酱油挥发性风味物质测定结果与分析

酱油香气主要由挥发性风味物质组成，其种类成分较为复杂，是衡量酱油品质的重要指标之一[29-31]。由表1和图1可知，在JY1酱油样品中，酱油挥发性风味物质种类有55种，其中化合物种类排序前三的为酯类、醇类和醛类，对应的风味化合物种类数分别为21，13，7种，而风味物质的相对含量占比排序前三的为醇类（67.63±4.87）%、酯类（16.70±1.88）%和酚类（5.48±0.42）%；在JY2中挥发性风味物质种类有53种，其中化合物种类排序前三的为酯类、醇类和醛类，種类数分别为22，13，6种，而风味物质的相对含量占比排序前三的为醇类（66.67±4.92）%、酯类（16.21±2.14）%和醛类（5.59±0.75）%；在JY3中挥发性风味物质种类有50种，其中化合物种类排序前三的为酯类、醇类和醛类，对应的风味化合物种类数分别为22，15，4种，而风味物质的相对含量占比排序前三的为醇类（46.53±2.85）%、酯类（28.99±2.14）%和酚类（20.57±0.59）%。

由上述数据可知，3组不同酿造周期的酱油样品挥发性风味物质种类较为接近，其中JY1、JY2和JY3的挥发性风味物质种类数目分别为55，53，50种，均为50种左右。随着酱油酿造时间的延长，酱油样品的挥发性风味物质种类出现一定的下降趋势。同时随着酱油酿造周期的延长，其挥发性风味物质的相对含量也在发生改变，尤其酿造270 d的酱油样品（JY3）的醇类风味物质相对含量减少明显，酯类和酚类风味物质相对含量增加明显，这可能是由于随着发酵周期的增加，一部分醇类转化为酯类等风味物质，一部分醇类物质随着酿造时间的延长而挥发；而酚类风味物质的增加机理需要后期进一步来探讨研究。总体而言，随着发酵周期的延长，3组酱油样品中挥发性风味成分的种类和相对含量都发生了一定的转变，一系列风味物质的相互作用使得酱油的风味更为丰富。

2.3 3组不同酿造周期的酱油PCA结果与分析

对不同酿造周期的3组酱油进行PCA主成分分析（JY1样品对应序号1，2和3；JY2样品对应序号4，5和6；JY3样品对应序号7，8和9），结果见图2。在95%的置信区间，主成分因子PC1和PC2分别解释了总方差的67.7%和24.5%，两者贡献率之和为92.2%，即PC1和PC2代表了数据92.2%的差异性。综上所述，3组不同酿造周期的酱油样品数据分离度好，具有明显区域分布特征，样品间平行性好，呈现出明显同类别聚类趋势，可对这3组不同酿造周期的酱油样品进行快速区分鉴定。

3 结论

本文通过测定成曲pH和中性蛋白酶指标，在酱油制曲成功的基础上，围绕着不同酿造周期（90，180，270 d）的酱油原油产品的挥发性风味物质来分析酿造时间对酱油挥发性风味的影响。基于GC-MS对不同酿造周期（90，180，270 d）的3组酱油样品进行挥发性风味物质的鉴定和分析，结果表明3组不同酿造周期的酱油样品挥发性风味物质种类较为接近，JY1（90 d）、JY2（180 d）和JY3（270 d）挥发性风味物质种类分别为55，53，50种，均为50种左右。不同酿造周期的酱油样品的挥发性风味物质种类有所差异，随着酱油酿造时间的延长，出现一定的下降趋势。此外，这3组酱油的挥发性风味物質相对含量和种类都发生了一定的转变，尤其是酿造270 d的酱油样品（JY3组），其醇类风味物质相对含量明显减少，而酯类和酚类风味物质相对含量明显增多。基于上述研究结果，可为酱油企业对酿造酱油的生产周期调整及酱油产品的后期调配提供新思路和技术指导。

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